PLA2 fosfolipasa A2 de Trypanosoma cruzi: caracterización in silico de la interacción enzima-sustrato.

Resumen

La lucha contra la enfermedad de Chagas ha inspirado el estudio del metabolismo del parásito Trypanosoma cruzi y, en particular, las interacciones enzima-sustrato para encontrar objetivos farmacológicos necesarios para eliminar el parásito sin el compromiso del huésped. Una enzima que podría cumplir estos requisitos es la fosfolipasa A2 (PLA2) de T. cruzi cuya existencia como proteína individual se ha sugerido con base experimental pero no se ha demostrado.

In vitro: se midió la actividad PLA2 mediante la hidrólisis del sustrato fluorescente bis-pirenoilfosfatidilcolina (10 mol %) incorporado en liposomas unilamelares pequeños, SUV, de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) en buffer HEPES 10 mM pH 7,2. Se ensayaron 50 ml de plasma filtrado  de ratones con diferentes parasitemias. Se activó la enzima llevando el calcio a 20 mM. Se obtuvieron espectros antes y después de cada determinación cinética. In silico: la secuencia de ADN Tc00.1047053510743.50 se tradujo en aminoácidos y se modeló por homología en el servidor phyre2. Se eligió el modelo de puntuación más alta que resultó en una molécula de tipo PLA2 con similitudes con la Factor activador de plaquetas (PAF) acetilhidrolasas (PAF-hidrolasa) humana. Se analizó la interacción del modelo estructural con sustratos posibles y con moniosialogangliósido GM1 que inhibe PLA2 de otras fuentes. El gen se identificó por la presencia de los aminoácidos que constituyen el sitio activo, la triada HIS, SER, ASP (GLU) que son responsables del ataque nuclefílico en el átomo de carbonilo del enlace carbono éster, actividad característica de PAF-hidrolasas. La unión al sustrato fue estudiada originalmente por Energías de Interacción Linear. Los complejos enzima-sustrato (PAF o DPPC como ligandos) se obtuvieron con el programa PatchDock. Las simulaciones de estados unido y disociados en solvente implícito (GBIS) se desarrollaron con NAMD. Los resultados fueron visualizados con VMD y Chimera.

La contribución electrostática aumenta aproximadamente 20kcal / mol en el estado enlazado, pero las interacciones VdW disminuyen 28kcal / mol, lo que hace que el término sea favorable para el estado enlazado. La unión de GM1, hipotético inhibidor, fue más favorable que para el PAF, lo que permitiría proponer una actividad inhibitoria de tipo competitivo.