HLA-DR y beta-tubulina en trampas extracelulares en cultivos de leucocitos autólogos humanos estimulados in vitro

Resumen

Las trampas extracelulares (TEs) son estructuras de cromatina y proteínas intracelulares que se extruyen en leucocitos en condiciones inflamatorias. Fueron descriptas primeramente en neutrófilos por Brinkmann y col (2004) denominándolas “trampas extracelulares neutrófilas” (NETs).  Las NETs además de su rol en mecanismos de defensa frente a microorganismos patógenos han sido implicadas en daño tisular, trombosis, autoinmunidad e incluso en inmunoedición de cáncer. Actualmente se conoce que otros leucocitos además de los neutrófilos son capaces de generar TEs. No todas las TEs son iguales, esto depende de la fuente de estimulación. Moléculas requeridas para la presentación de antígenos y activación de células T como HLA-DR (CMH clase II) pueden expresarse en neutrófilos estimulados.  La presencia de beta-tubulina y HLA-DR no se ha informado en las TEs. El objetivo del presente trabajo fue generar TEs en cultivos de leucocitos expuestos a estimuladores como lipopolisacarido (LPS) o a péptidos formilados (fMLP) y llevar a cabo el marcado de beta-tubulina y HLA-DR.

Cultivos autólogos de leucocitos de muestras de sangre humana sana (n = 10) con consentimiento informado (Comité de Ética del HNC, FCM), anticoagulados con heparina, fueron  estimulados con 25 ng/ml de LPS o 0,25 ng/ml de fMLP,  30 minutos. Técnica de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-beta tubulina y anti HLA-DR, tinción de ADN con DAPI. Muestras de sangre apareadas proporcionaron los controles. Las TEs fueron visualizadas por microscopia de Inmunofluorescencia y el porcentaje de células que liberan TEs fue calculado como promedio de cinco campos (400x) normalizado por número total de células.

La estimulación con LPS o con fMLP incrementó el nivel basal de las TEs de leucocitos derivadas de donantes sanos (p<0,001, test t de Student para muestras apareadas). Moléculas beta-tubulina y HLA-DR fueron localizadas en las TEs de todos los grupos.

La liberación de HLA-DR en las TEs puede influir en el entorno que favorece a la vía clase II de presentación de antígenos. La expresión de beta-tubulina y HLA-DR contribuye a una mejor comprensión de la composición de las TEs generadas por diferentes estimuladores.  Esto puede tener importancia como objetivo terapéutico en enfermedades en cuya patogenia se encuentran implicadas las TEs.