10.31047/1668.298x.v38.n2.32790

Articulos

Germinación, tiempo hídrico y análisis isotópico de Vicia villosa Roth. bajo condiciones de estrés hídrico y salino

Germination, hydrotime and isotopic analysis of Vicia villosa Roth. under water and salinity stress.

P Perissé 1

C. V. Arias 1

S. Nogués Mestres 1

1 Perissé, P. (ORCID: 0000-0002-7963-7957) y Arias, C. V (ORCID: 0000-0003-3345-030X): Universidad Nacional de Córdoba, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Botánica Morfológica, Córdoba, Argentina. Nogués Mestres, S. (ORCID: 0000-0002-1694-0924): Universidad de Barcelona, Facultad de Biología, Biología Evolutiva, Ecología y Ciencias Ambientales. Barcelona, España. Correspondencia a: pperisse@agro.unc.edu.ar

Fecha de recepción: 22/04/2021

fecha de aceptación: 05/10/2021

RESUMEN

Vicia villosa es un recurso forrajero potencial en áreas marginales asociado con su resiembra natural y sus atributos agronómicos. Los objetivos del trabajo fueron registrar y analizar el patrón de absorción de agua, determinar el porcentaje de germinación, estimar los parámetros de tiempo hídrico y establecer la composición isotópica de ¹³C y ¹⁵N de la plántula cuando Vicia v¡llosa germina en condiciones de estrés hídrico y salino. Los ensayos para determinar el patrón de absorción y la respuesta a la germinación se realizaron según el tratamiento: control (agua destilada) y soluciones con potencial agua (Y_a): -0,3; -0,6; -0,8; -1 y -1,2 MPa. Los osmolitos fueron poliethylene glicol (PEG) y cloruro de sodio (NaCl). La composición isotópica de la materia orgánica total (MOT) se determinó en condiciones control, -0,8 y -1 MPa. La absorción de un 125 % de agua desencadenó la germinación. Se estimó que con ¥_a de -0,6 y -0,8 MPa se alcanzaría un 90 % de germinación en estrés hídrico y salino. Los tratamientos de PEG y NaCl mostraron un enriquecimiento en ¹³C y un empobrecimiento en ¹⁵N respecto al control. Los resultados experimentales indican que esta especie es más tolerante a la salinidad que al estrés hídrico.

Palabras clave: leguminosa forrajera, sequía, salinidad, semilla, S¹³C, S¹⁵N.

SUMMARY

Vicia villosa is a potential forage resource in marginal areas associated with its natural reseeding and agronomic attributes. The objectives of this work were to record and analyze the water absorption pattern, determine the germination percentage, estimate the hydrotime parameters and establish the ¹³C and ¹⁵N isotopic composition of the seedling, when V. villosa germinates in water and salinity stress conditions. The assays to determine the water absorption pattern and the response to germination were carried out according to the treatment: control (distilled water) and the solutions with potential water (Y_a): -0.3; -0.6; -0.8; -1 and -1.2 MPa. The osmolytes were Polyethylene Glycol (PEG) and sodium chloride (NaCl). The isotopic composition of the total organic matter (MOT) was determined under control conditions, -0.8 and -1 MPa. The absorption of 125 % of water triggered the germination. It was estimated that 90 % of germination would be achieved with ¥_a of -0.6 and -0.8 MPa in water and salinity stress. PEG and NaCl treatments showed an enrichment in ¹³C and a depletion in ¹⁵N with respect to the control. The experimental results lead to the conclusion that this species is more tolerant to salinity than to water stress.

Key Words: forage legume, drought, salinity, seed, 8¹³C, S¹⁵N.

INTRODUCCION

Entre las leguminosas, el género Vicia comprende, según Bryan y Hughes (2011), aproximadamente entre 160 y 200 especies de importancia económica que son cultivadas como abono verde, forraje o alimento para consumo humano por ejemplo: Vicia faba, V. sativa, V. hirsuta, V. narbonensis, V. villosa, entre otras (Gunn, 1981; Marin et al., 1998; Haffani et al., 2017). En Europa Central es común el cultivo de V. villosa conocida con el nombre vulgar de “vicia velluda” (Nadal-Moyano et al., 2004) y en Estados Unidos, con el nombre de “veza invernal”, se utiliza en siembras de otoño y presenta un mejor desempeño que V. sativa. Su adopción en áreas productivas marginales se asocia con su alto potencial de resiembra natural y sus deseables atributos agronómicos (Renzi et al., 2017).

El proceso de germinación es de fundamental importancia ya que influye directamente en el crecimiento, determinando el éxito en el establecimiento del cultivo (Baskin y Baskin, 2014). Durante la imbibición, el movimiento y la velocidad de entrada de agua depende de las características intrínsecas de la semilla y de la permeabilidad de las cubiertas seminales; que a su vez es influenciada por la morfología, composición y el contenido inicial de agua de la semilla (Copeland y McDonald, 2001). Es ampliamente reconocido que las semillas presentan un patrón de absorción de agua trifásico (Hadas y Russo, 1974; Bewley y Black, 1994; Bradford, 1995) propio de cada especie y que las semillas deben alcanzar un nivel mínimo de hidratación (NMH) para desencadenar la germinación (Hadas, 1977; Perissé et al., 2002; Perissé y Planchuelo, 2004).

La sequía por falta de lluvia o por retraso en la irrigación es uno de los factores limitantes para la producción de un cultivo y es un problema severo en muchas regiones del mundo (Lefi et al., 2004). En suelos salinos, sin bien el potencial osmótico puede ser de una magnitud tal que afecte la imbibición de agua, en la mayoría de los casos es el potencial mátrico el que determina la disponibilidad de agua en el suelo para la semilla (Finch-Savage y Bassel, 2016). Además, la salinidad puede tener efectos tóxicos sobre la semilla (Munns, 2002).

La germinación en condiciones limitantes de agua se correlaciona con el alcance del nivel mínimo de hidratación (NMH), que permite iniciar el alargamiento celular y la aparición de la radícula (Hegarty, 1978). Por lo tanto, es necesario conocer si ocurren variaciones en el patrón de absorción cuando las semillas de V. villosa se encuentran en medios con diferentes potenciales agua debido a condiciones de estrés hídrico o salino. Sin embargo, aun en un suelo con una adecuada disponibilidad de agua, existe una dispersión entre la primera y la última semilla que completa la emergencia, siendo ésta un indicador de la uniformidad y la calidad de la población de las semillas (Bradford, 1995). El análisis de tiempo hídrico proporciona varios índices de calidad de las semillas en relación con la tolerancia al estrés, la velocidad y la uniformidad de la germinación (Bradford y Still, 2004). Existen varios estudios realizados con esta metodología para evaluar el comportamiento de diferentes especies bajo deficiencia hídrica (Hu et al., 2013; Hu et al., 2015; Farahinia et al., 2017; Renzi et al., 2017; Zhang et al., 2020) y bajo condiciones de salinidad (Cavallaro et al., 2016); sin embargo, no se dispone de antecedentes sobre modelo de tiempo hídrico para la germinación de V. villosa en condiciones de salinidad.

El estudio de las respuestas fisiológicas de las plantas que crecen bajo condiciones limitantes puede proporcionar información para predecir futuras respuestas en un ambiente cambiante (Taiz y Zeiger, 2010). La identificación de nuevos criterios fisiológicos, como la composición isotópica de la materia orgánica (MO) de las plantas, resulta una herramienta de utilidad para evaluar el impacto del ambiente y la tolerancia de las plantas al estrés (Araus et al., 2008). La abundancia natural de isótopos estables en la MO de las plantas, como el carbono (¹³C) y el nitrógeno (¹⁵N), varía en condiciones de estrés hídrico o salino. Bajo estas condiciones ambientales el flujo de entrada de CO₂ en las hojas disminuye por la menor conductancia estomática y esto provoca un enriquecimiento de ¹³C por la menor discriminación de la enzima Rubisco durante la fotosíntesis (Barbour y Farquhar, 2000). A su vez, estas limitaciones en el mecanismo fotosintético provocan un empobrecimiento de ¹⁵N en la MO (Tcherkez y Hodges, 2008) ya que existe una relación directa entre la fotosíntesis y el metabolismo del nitrógeno (Taiz y Zeiger, 2010). Por lo tanto, se considera a la composición de isótopos de carbono (8¹³C) y de nitrógeno (8¹⁵N) como indicadores para medir los efectos de la sequía y salinidad en las plantas (Serret et al., 2020).

Con esta premisa y con la finalidad de seleccionar especies y cultivares para un ambiente donde predomina el estrés hídrico y salino, se consideran de importancia los estudios sobre esta especie con promisorias posibilidades de implantación para zonas marginales. Los objetivos del presente trabajo fueron: registrar y analizar el patrón de absorción de agua durante la imbibición, determinar el porcentaje de germinación, estimar los parámetros de tiempo hídrico y establecer la composición isotópica de ¹³C y ¹⁵N de la plántula, cuando V. villosa cv. 'Tolse FCA' germina en condiciones de estrés hídrico y salino.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Las semillas de V. villosa Roth. cv. 'Tolse FCA' se obtuvieron de un ensayo experimental realizado en el campo de la Facultad de Ciencias

Agropecuarias, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina (31° 28' 44,4” S, 64° 00' 20,5" O). Los frutos fueron cosechados y trillados a mano. Las semillas se almacenaron a 4 °C con un contenido de humedad de 9,6 % hasta el momento de la realización de los ensayos.

Patrón de absorción de agua

Para determinar el patrón de absorción de agua se colocaron cuatro repeticiones de diez semillas, previamente pesadas en cajas de plástico de 15 x 15 x 9 cm, en cuya base se colocó papel de germinación embebido en distintas soluciones, según el tratamiento: control (agua destilada) y diferentes potenciales agua (Y_a): -0,3; -0,6; -0,8; -1 y -1,2 Mega Pascal (MPa). El osmolito utilizado para simular el estrés hídrico fue polietilenglicol (PEG 6000), los Y_a se obtuvieron a partir de distintas concentraciones de PEG, según la fórmula de Michel (1983). Para simular las condiciones de estrés salino se utilizaron soluciones de cloruro de sodio (NaCl) según la metodología de Sosa et al. (2005). Los Y_a se controlaron con un microvoltímetro de punto de rocío, marca Wescor (EE UU).

Se aplicó un pre tratamiento de enfriamiento a 5 °C durante 7 días (International Seed Testing Association [ISTA], 2004). En los tratamientos con PEG, como es un carbohidrato cuya dilución se ve afectada por la temperatura, se prepararon las soluciones correspondientes para el período de 5 °C y otras para el período en cámara de germinación a 20 °C. Las cajas de germinación se taparon y colocaron en bolsas plásticas cerradas para evitar diferencias de Y_a por evaporación y exclusión, y el papel de germinación se renovó con soluciones frescas de PEG y NaCl cada 72 h con la finalidad de mantener constante el Y_a. Luego del pre tratamiento en frío, las cajas se trasladaron a la cámara de germinación a 20 ±1 °C con luz fluorescente fría de 800 a 1200 Lux, con un fotoperíodo de 8/16 h (luz/oscuridad) (ISTA, 2004).

Se determinó el patrón de absorción de agua en función del tiempo, midiendo los gramos de agua absorbida cada 24 h, en relación con la unidad de peso fresco (PF) (Le Deunff et al., 1989; Perissé y Planchuelo, 2004). Se consideró el inicio de la fase 3 cuando se observó la emergencia de 2 mm de radícula a través de la cubierta seminal (Bewley y Black, 1994).

Se confeccionaron las curvas de absorción de agua en función del tiempo y se determinó el nivel de absorción a partir del cual comienza la fase de crecimiento de la radícula, al que se denominó nivel mínimo de hidratación (NMH).

Ensayo de germinación

Las pruebas de germinación se llevaron a cabo según la metodología descripta anteriormente para los siguientes tratamientos: control (agua destilada) y soluciones a -0,3; -0,6; -0,8; -1 y -1,2 (MPa), obtenidas con PEG y NaCl para simular el estrés hídrico o salino respectivamente. Las muestras o unidades experimentales consistieron de 25 semillas con cuatro repeticiones por tratamiento, siguiendo un diseño en bloques completamente aleatorizados. Se realizaron recuentos diarios del número de semillas germinadas, hasta el décimo cuarto día después de la siembra (DDS) en el cual se dio por finalizado el ensayo. La germinación completa se definió como el porcentaje de germinación que es igual al máximo porcentaje obtenido para las semillas que germinan en el tratamiento control (Hadas, 1977).

Se evaluaron las siguientes    variables:

porcentaje de germinación (PG), porcentaje final de germinación (PFG) y el número de días para alcanzar el 50 % de germinación (G50).

donde p_gc son los porcentajes calculados, p_g los porcentajes experimentales, y n la cantidad de porcentajes en el tratamiento. El error medio se determinó como:

Las semillas que no germinaron se sometieron a una prueba de recuperación para indagar si existieron problemas de toxicidad y evaluar la potencialidad de recuperación. Las semillas de cada tratamiento se colocaron a germinar en condiciones óptimas (agua destilada, 20 °C y 8/16 h de luz/oscuridad). A los 7 días se estableció el número de semillas que germinaron denominándolas “semillas recuperadas” (Ungar, 1995).

Para el análisis de la composición isotópica de la materia orgánica total (MOT) se seleccionaron cuatro plántulas crecidas bajo condiciones control, -0,8 y -1 MPa para los tratamientos con PEG y NaCl. Las muestras de MOT se secaron en estufa a 60 °C durante 48 h, luego se trituraron y homogeneizaron hasta obtener un polvo fino. Se pesaron 0,8 mg de submuestras en cápsulas de estaño (SYLAB Elemental Microanalisys, UK), de 8 x 5 mm de tamaño, con microbalanza de precisión (Mettler Toledo, España). Los análisis se realizaron en el Centro Científico y Tecnológico (CCiT) de la Universidad de Barcelona utilizando un Elemental Analyzer Flash 112 (CarboErba, Milán) acoplado a una Interfaz Delta C Confio III de Espectrometría de Masas de Relación Isotópica (EA-IRMS) (Termo Finnigan, Alemania).

Los resultados de la relación de isótopos de carbono se expresaron con notación 8 y en partes por mil (%o) de acuerdo con la siguiente ecuación:

R muestra R estándar

donde R muestra es la relación ¹³C/¹²C de la MOT y R estándar se refiere a la relación ¹³C/¹²C del estándar internacional V-PDB (Vienna Pee Dee Belemnite) (International Atomic Energy Agency [IAEA], 1983a).

Los resultados de nitrógeno en la MOT también se expresaron en notación 8 utilizando estándares secundarios internacionales de relaciones

Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó el paquete de software Infostat (Di Rienzo et al., 2011). Los efectos de PEG y NaCl sobre el porcentaje final de germinación (PFG) se analizaron utilizando ANOVA de una vía (con siete niveles de tratamiento: control, -0,8, -1, -1,2 MPa de PEG y NaCl). Los parámetros de la composición isotópica de la MOT se compararon mediante ANOVA de una vía (con cinco niveles de tratamiento: control, -0,8 y -1 MPa de PEG y NaCl). Las diferencias entre los valores medios se evaluaron mediante la prueba de Duncan con un nivel de significancia del 5 %. Los parámetros medidos fueron graficados utilizando el programa SigmaPlot (versión 11.0).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Patrón de absorción de agua

Durante los primeros tres días de ensayo no se observaron variaciones en el patrón de absorción entre los tratamientos (Figura 1). Sin embargo, las curvas se diferenciaron a partir del cuarto día tanto para los tratamientos con PEG (Figura 1A) como para aquellos con NaCl (Figura 1B). Si bien la fase I de imbibición quedó claramente delimitada, no ocurrió lo mismo con la fase II, ya que no se observó la meseta correspondiente a la activación metabólica. La absorción de un 125 % de agua (1250 gr de agua Kg^-1), desencadenó el paso a la fase III, esto es, la emergencia y el crecimiento de la radícula (germinación sensu stricto) y, por lo tanto, determinó el nivel mínimo de hidratación (NMH). Estos datos concuerdan con lo citado para Lupinus albus y Lupinus angustifolius por Perissé et al. (2002), Phaseolus vulgaris por Shafaei et al. (2016) y Cicer arietinum por Gómez-Favela et al. (2017). A su vez, se observó que para un mismo Y_a los tratamientos con NaCl alcanzaron el NMH antes que los tratamientos con PEG.

Ensayo de la germinación

Los resultados muestran que para el cultivar de V. villosa 'Tolse FCA' bajo la condición control, el 90 % de las semillas germinaron en forma sincrónica a los cuatro días después de la siembra (DDS) y la germinación completa (99 %) se alcanzó a los 12 DDS (Figura 2). Estos resultados constituyen un buen indicador de la uniformidad y por lo tanto de la calidad de la muestra tal como lo señalan Bradford y Still (2004). Además, a -0,3 MPa tanto en los tratamientos con PEG como con NaCl se alcanzó la germinación completa (Tabla 1).

Sin embargo, se registró una disminución significativa (p < 0,05) en el PFG en los distintos tratamientos de estrés con Y menores a -0,3 MPa (Tabla 1). Estos resultados son concordantes con lo señalado para leguminosas como Lupinus albus y Lupinus angustifolius (Perissé et al., 2002) y Prosopis strombulífera (Llanes et al., 2005). Bajo condiciones de estrés hídrico, equivalente a -0,6 MPa, el cultivar estudiado reflejó una mejor respuesta a la germinación (PFG 89 %) comparado con lo reportado por Saglam et al. (2010) para Lens culinaris (PFG 50-70 %) y por Perissé et al. (2002) para L. albus (PFG 75 %) y L. angustifolius (PFG 15 %).

Tabla 1: Porcentaje final de germinación para V. villosa cv. Tolse FCA bajo condiciones de estrés hídrico y salino. Valores medios seguidos de letras iguales no difieren significativamente (p > 0,05)

A medida que los potenciales agua disminuyeron, la respuesta a la germinación bajo condiciones de estrés salino fue superior en comparación con las de estrés hídrico (Tabla 1). Esto concuerda con lo señalado por Murillo-Amador et al. (2002) para Vigna unguiculata y Cavallaro et al. (2016) para Ceratonia siliqua, quienes reportaron una mejor respuesta a la germinación bajo estrés salino en relación con el estrés hídrico.

Por otro lado, en el control se alcanzó el G50 entre el segundo y tercer DDS y en los tratamientos con PEG y NaCl a Y_a de hasta -0,8 MPa, se superó el G50 a los diez y cuatro DDS, respectivamente (Figura 2). Las diferencias en relación al tiempo para alcanzar el G50 entre ambos tratamientos, se explican en función de los patrones de absorción de agua, donde a igualdad de potencial, la tasa de absorción de agua fue más lenta en los tratamientos de estrés hídrico.

Parámetros de tiempo hídrico

La Figura 3 muestra las rectas de tiempo hídrico obtenidas con el modelo de Gummerson (1986). Se observó que para alcanzar el G50 en condiciones de estrés hídrico (PEG), el potencial base (Y_B) fue de -1,00 MPa y para el tratamiento de estrés salino (NaCl) fue de -1,57 MPa. Además, se estimó que con un potencial de -0,6 y -0,8 MPa se alcanzaría un 90 % de germinación bajo condiciones de estrés hídrico y salino, respectivamente. Del mismo modo, fue posible predecir que el tiempo necesario para alcanzar el G50 a un potencial de -0,8 MPa sería de 11 días bajo condiciones de estrés hídrico (Figura 3A) y de cuatro días en salinidad (Figura 3B). Por otra parte, la recta de regresión obtenida del análisis probit (Figura 4) para condiciones de estrés hídrico corta al eje de abscisas en -1,06 MPa, valor correspondiente al T_b (50) (Figura 4A) y para los ensayos de estrés salino, corta al eje de abscisas en -1,54 MPa (Figura 4B).

Los parámetros de tiempo hídrico en ambos modelos se muestran en la Tabla 2; se observó que en condiciones de salinidad el valor de 0_H se incrementó, el T_b (50) disminuyó y el ct^_b fue mayor comparado con el tratamiento de estrés hídrico.

El 0_H calculado, según el modelo de Gummerson, en estrés hídrico para Vicia villosa (Tabla 2) fue superior en un 24 % al valor medio (1,78) citado por Renzi et al. (2017), y un 69 % al de Vicia amoena (1,3). Sin embargo, fue inferior a los valores para Vicia angustifolia (3,7), Vicia unijuga (4,3) y Vicia sativa (3,8) según Hu et al. (2015). En

contraposición, bajo condiciones de salinidad el 0_H para V. villosa (Tabla 2) fue inferior a lo señalado por Cavallaro et al. (2016) en ocho genotipos de Ceratonia siliqua (5,5 y 9,5). Las diferencias entre los valores de 0_H en las especies estudiadas, si bien son un indicador de la velocidad de germinación, se explican teniendo en cuenta que el valor de la constante 0_H es característico de cada especie

Figura 3: Relación entre potencial base (Tb), tiempo y porcentaje de germinación de V. villosa cv. 'Tolse FCA' bajo condiciones de estrés

Tabla 2: Parámetros de tiempo hídrico para V. villosa cv. ‘Tolse FCA’ obtenidos con los modelos de Gummerson y Bradford para los tratamientos de estrés hídrico y salino, y diferencia porcentual entre los resultados de ambos modelos

Por otro lado, el Y_B(50) determinado para V. villosa en condiciones de estrés hídrico, calculado con el modelo de Gummerson y de Bradford, concordó con lo citado para esta especie (-1,07) por Renzi et al. (2017). Del mismo modo se mantuvo dentro de los rangos señalados por Hu et al. (2015) para V angustifolia (-1,29 MPa), V amoena (-0,64 MPa), V unijuga (-1,29 MPa) y V. sativa (-1,36 MPa). También fue consistente con lo indicado por Cavallaro et al. (2016) para distintos genotipos de C. siliqua (-1,28 y -1,74 MPa) bajo condiciones de salinidad.

La Figura 5 muestra la comparación entre los resultados experimentales y los obtenidos con el modelo de tiempo hídrico a partir de la Ec.1. Las mayores diferencias en el PFG entre los datos experimentales y modelados en los tratamientos con PEG ocurrieron a valores de Y -0,6 y -0,8 MPa, subestimando el modelo entre un 10 y 6 %, respectivamente (Figura 5A). Mientras que para los tratamientos de NaCl los resultados del modelo presentaron diferencias en el PFG inferiores al 10 % con respecto a los experimentales en los tratamientos de hasta -1 MPa (Figura 5B). Estas diferencias se explican teniendo en cuenta que una imbibición más lenta, a los potenciales mencionados, implicaría una variación en la constante de tiempo hídrico (0_H) y pondría de manifiesto las discrepancias a potenciales menores o iguales a -0,6 MPa sin alterar Y_B o ct^_b (Bradford, 1990). Los errores medios globales de los porcentajes de germinación fueron 4,405 y 6,023 y los coeficientes de regresión globales R² fueron 0,97 y 0,96 para los tratamientos con PEG y con NaCl, respectivamente. La Tabla 3 muestra que los errores medios para los tratamientos con PEG son en general inferiores a los correspondientes con los tratamientos con NaCl. Además, los coeficientes de regresión R² correspondientes a los tratamientos con PEG y con NaCl muestran un buen ajuste del modelo para ambos tratamientos.

Ensayos de recuperación

En general, se observó una mayor recuperación de los tratamientos de estrés hídrico (PEG) en comparación con aquellas semillas sometidas a estrés salino (Tabla 4). Los altos porcentajes de recuperación se explicarían por un efecto osmoprotector del PEG. Esto es debido a que el sistema de membranas del embrión, que previo a la imbibición de las semillas se encuentran en fase gel, cuando se embeben lentamente restablecen su composición líquido cristalina hasta completar la fase I del patrón de absorción de agua y el embrión se mantiene en la fase II (Bewley y Black, 1994). Así, las membranas conservan su propiedad de permeabilidad selectiva y evitan la pérdida de electrolitos (Bewley y Black, 1994). El embrión mantiene su viabilidad y sólo se evita el pasaje a la fase III. Contrariamente, en los tratamientos con estrés salino las semillas imbiben rápidamente y las membranas en la transición de la fase gel a líquido cristalino conducen al daño por imbibición violenta. Los bajos porcentajes de recuperación, en las semillas no germinadas de los tratamientos más severos de estrés salino, expresan la alteración del equilibrio iónico y acuoso que genera un estrés hiperosmótico, desbalance iónico y toxicidad, que compromete la viabilidad de las semillas expuestas a altas concentraciones salinas (Munns, 2002; Taiz y Zeiger, 2010).

Figura 5: Comparación de los porcentajes de germinación acumulados experimentales y modelizados con el tiempo hídrico para V. villosa cv. ‘Tolse FCA’ bajo condiciones de estrés hídrico, PEG (A) y salino, NaCl (B) a distintos potenciales agua (MPa). Línea discontinua: datos experimentales, línea continua: datos modelizados. Días después de la siembra (DDS).

Tabla 3: Error medio entre los valores experimentales y modelizados y, coeficiente de regresión para V. villosa cv. 'Tolse FCA' bajo condiciones de estrés hídrico (PEG) y salino (NaCl) a distintos potenciales agua (MPa)

Tabla 4: Porcentaje de semillas recuperadas de V. villosa cv. 'Tolse FCA' luego de transferidas a condiciones estándares de germinación según ISTA (2004) (MPa)_PEG (%)_NaCl (%)

Composición isotópica de la materia orgánica total (MOT)

La composición isotópica de ¹³C (8¹³C) en la MOT de las plántulas germinadas y crecidas en condiciones control fue cercano al valor promedio para plantas C₃ (-26 %₀) como lo indican Cerling et al. (1997) (Figura 6A). Las plántulas crecidas en condiciones control presentaron un desarrollo de plántula normal con la presencia de nomofilos fotosintetizantes. Por lo tanto, el menor contenido de ¹³C fijado en la materia orgánica vegetal se puede relacionar con la discriminación ejercida por la enzima Rubisco, hacia el isótopo más pesado durante el proceso de fotosíntesis de estas hojas (Farquhar et al., 1989).

En las plántulas bajo los tratamientos PEG y NaCl, la 8¹³C de la MOT se mantuvo dentro del rango esperado (-22 a -30 %₀) para plantas C₃, como sostienen Cerling et al. (1997), pero se observó un enriquecimiento significativo (p < 0,05) en el isótopo más pesado (¹³C) en dichos tratamientos con respecto al control (Figura 6A). Estos resultados podrían estar relacionados con la menor disponibilidad de agua en el medio de crecimiento, lo que conduce al cierre de estomas o disminución de la conductancia estomática para reducir la pérdida de agua por transpiración. Cuando el flujo de CO₂ se ve reducido la Rubisco discrimina menos al ¹³C en su incorporación al Ciclo Calvin (Barbour y Farquhar, 2000).

Figura 6: Composición isotópica de carbono 13 (A) y nitrógeno 15 (B) en la materia orgánica total de plántulas de V. villosa cv. ‘Tolse FCA’ crecidas bajo condiciones de estrés hídrico, PEG y salino, NaCl a distintos potenciales agua (MPa)

La composición isotópica de ¹⁵N (8¹⁵N) en la MOT fue de -0,2 %o para las plántulas crecidas bajo condiciones control. Este resultado estuvo dentro del valor esperado para plantas que dependen únicamente de simbiontes bacterianos para la fijación de N₂ ya que el 8¹⁵N del aire es cero. En concordancia con lo señalado por Yoneyama et al. (1986) y Makarov (2009), el primer fraccionamiento isotópico ocurre durante la fijación simbiótica de N₂ con una preferencia por el ¹⁴N sobre ¹⁵N, con un valor 8¹⁵N entre -0,2 a -2 %o en la MOT de toda la planta. Debido a las condiciones experimentales de crecimiento en este ensayo, las plántulas presentaron una limitación en la formación de nódulos y la fijación de nitrógeno atmosférico (N₂) por parte de las raíces. Por lo tanto, este valor de la 8¹⁵N procedería de la reserva proteica almacenada en la semilla y que fue el N₂ fijado por los nódulos bacterianos de la planta madre (Yoneyama et al., 1986). Este resultado es consistente con lo indicado por Piao y Liu (2012), quienes citaron un valor de la 8¹⁵N en las semillas de V. villosa de -0,3 %o.

En las plántulas bajo los tratamientos PEG y NaCl la 8¹⁵N en la MOT se mantuvo dentro del rango esperado (-10 a + 10 %₀) indicados por Evans (2001). Sin embargo, se observó un empobrecimiento significativo (p < 0,05) en el isótopo más pesado (¹⁵N) respecto al control (Figura 6B). El empobrecimiento de ¹⁵N en la MOT bajo condiciones de estrés podría estar relacionado con las limitaciones de los mecanismos fotosintéticos de la planta en respuesta al medio de crecimiento (Tcherkez y Hodges, 2008).

Como se mencionó anteriormente, la disminución de la conductancia estomática debido al incremento de los Y_a ya sea por salinidad o sequía, es la principal causa en la disminución del mecanismo fotosintético y crecimiento en la plántula (Munns y Tester, 2008). Las biomoléculas como aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, coenzimas, fosfolípidos y clorofilas están constituidas por esqueletos carbonados y nitrógeno, lo que evidencia la relación entre la fotosíntesis y el metabolismo del nitrógeno. Además, coexiste una dependencia de ATP y NADPH producido en la fotosíntesis, con las reacciones metabólicas del nitrógeno (Taiz y Zeiger, 2010). Por lo tanto, la alteración en los procesos serían los determinantes de la composición isotópica ¹⁵N en la plántula.

A su vez, se observó que a menor potencial hídrico (-1 MPa) hubo un mayor enriquecimiento en ¹³C y fraccionamiento de ¹⁵N, siendo más significativo (p < 0,05) en el tratamiento con PEG respecto al tratamiento NaCl. Estos resultados podrían estar asociados a la menor disponibilidad de agua retenida por el osmolito PEG en el medio de crecimiento.

CONCLUSIONES

El alto porcentaje de germinación (99 %) alcanzado por las semillas de Vicia villosa cv. ‘Tolse FCA', bajo condiciones control, evidenció una buena calidad y uniformidad de la muestra de semillas.

El estudio reveló que el nivel mínimo de hidratación (NMH) requerido por las semillas para germinar es de 125 % de imbibición de agua sobre el peso fresco y, que existe una variación en la curva de patrón de absorción de agua a medida que disminuyen los potenciales agua, tanto para el tratamiento de estrés hídrico como el salino.

Los resultados experimentales permiten concluir que V. villosa cv. ‘Tolse FCA' es más tolerante a la salinidad que al estrés hídrico en la germinación. Si bien ambos tratamientos provocaron un retraso en el proceso de germinación y la emergencia, el NaCl fue menos perjudicial que los tratamientos con PEG. Sin embargo, el potencial de recuperación fue significativamente alto en las semillas luego del estrés hídrico, lo que evidencia que la viabilidad de las semillas se mantiene. Los parámetros de tiempo hídrico y la composición isotópica de ¹³C y ¹⁵N en la materia orgánica también pusieron de manifestó que esta especie sometida a estrés salino exhibe una mejor respuesta que bajo condiciones de estrés hídrico. Por lo tanto, el cultivar ‘Tolse FCA' de V. villosa mostraría un potencial promisorio para su uso como pastura o abono verde en suelos salinos o con déficit hídrico.

A su vez, el uso de los parámetros de tiempo hídrico y la composición isotópica de la MO como integradores fisiológicos podrían ser de utilidad en programas de mejoramiento como criterios de selección desde las etapas tempranas de crecimiento y de esta manera identificar cultivares de V. villosa con mejor comportamiento y tolerancia al estrés hídrico y salino.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación contó con la financiación de la Secretaría de Ciencia y Técnica (SECyT) de la Universidad Nacional de Córdoba. Los autores agradecen la colaboración del Ing. Ricardo Luis Marini en la implementación de los modelos matemáticos.

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