doi.org/10.31047/1668.298x.v38.n1.26937
Art�culos
Determinaci�n de patotipos de Verticillium dahliae Kleb. provenientes de las regiones oliv�colas del centro y oeste de Argentina y pruebas de virulencia en algod�n
Determination of Verticillium dahliae Kleb. pathotypes from the olive regions of central and western Argentina and virulence tests in cotton.
V Gonz�lez 1 *
M Paccioretti 1
D Rattalino 1
R. J Taborda 1
F Carrasco 1
F Arias 1
M. L Otero 1
1 Gonz�lez, V (ORCID: 0000-0003-3781-0181) y Taborda, R. J. (ORCID: 0000-0001-8420-6054): Universidad Nacional de C�rdoba, Facultad de Ciencias Agropecuarias, F�lix Marrone 746, Ciudad Universitaria, C. P 5000, C�rdoba, Argentina. Paccioretti, M. (ORCID: 0000-0002-7146-7922): Instituto Nacional de Tecnolog�a Agropecuaria, Instituto de Patolog�a Vegetal, Av. 11 de septiembre 4755, C. P. 5119, C�rdoba, Argentina. Rattalino, D. (ORCID: 0000-0002-6531-9333): Universidad Nacional de Chilecito, 9 de Julio 22, C. P. 5360, Chilecito, La Rioja, Argentina. Carrasco, F D. (ORCID: 0000-0002-0580-8311): Instituto Nacional de Tecnolog�a Agropecuaria, Estaci�n Experimental Agropecuaria Catamarca, Ruta 33 km 4,5, C. P 4705, Catamarca, Argentina. Arias, F. (ORCID: 0000-0003-4002-7446): Instituto Nacional de Tecnolog�a Agropecuaria, Estaci�n Experimental Agropecuaria Mendoza, San Martin 3853 C. P 5507, Mendoza, Argentina. Otero, M. L. (ORCID: 0000-0002-3164-3880): Instituto Nacional de Tecnolog�a Agropecuaria, Instituto de Patolog�a Vegetal, Av. 11 de Septiembre 4755, C. P. 5119, C�rdoba, Argentina y Unidad de Fitopatolog�a y Modelizaci�n Agr�cola, Instituto de Patolog�a Vegetal- CONICET, Av. 11 de Septiembre 4755, C. P. 5119, C�rdoba, Argentina.
* Correspondencia a: valeriagonzalez@agro.unc.edu.ar
Fecha de recepci�n: 17/02/2020
fecha de aceptaci�n: 07/04/2021
RESUMEN
La verticilosis causada por el hongo habitante de suelo Verticillium dahliae Kleb. es una enfermedad que afecta el cultivo del olivo (Olea europaea L.) y algod�n (Gossypium hirsutum L.), entre otros. De acuerdo a su patogenicidad, los aislados del pat�geno pueden clasificarse como patotipos defoliantes (D) y no defoliantes (ND). Los objetivos de este estudio fueron: i) determinar los patotipos de una colecci�n de 42 aislados de V. dahliae provenientes de plantas de olivo de las provincias de Catamarca, C�rdoba, La Rioja y Mendoza existente en el IPAVE-INTA C�rdoba, y ii) evaluar la virulencia de ocho cepas recientemente aisladas pertenecientes a dicha colecci�n. Se utiliz� la t�cnica de PCR anidado para el an�lisis molecular de los aislados del hongo y la evaluaci�n de la virulencia se realiz� mediante inoculaciones artificiales en plantines de algod�n con un dise�o completamente aleatorizado. El 100 % de los aislados fueron caracterizados como ND. Dos cepas provenientes de La Rioja, dos de Catamarca y una de Mendoza, fueron significativamente m�s virulentas (p< 0,05) para el �rea bajo la curva de progreso de la enfermedad relativa, severidad media final, porcentaje de severidad media e �ndice de severidad.
Palabras clave: verticilosis; patotipo; aislamientos; severidad; olivo.
SUMMARY
Verticillium wilt caused by the soil-borne fungus Verticillium dahliae Kleb. is a disease that affects olive (Olea europaea L.) and cotton crops, among others. According to their pathogenicity, V. dahliae isolates can be classified as defoliating (D) and non-defoliating (ND). The objectives of this study were: i) to determine the pathotypes of a collection of 42 V dahliae isolates from olive plants in the provinces of Catamarca, C�rdoba, La Rioja and Mendoza kept at IPAVE-INTA C�rdoba, and (ii) to evaluate the virulence of eight recently isolated isolates belonging to this collection. Nested PCR was used for molecular analysis of the 42 fungal isolates and virulence evaluation was performed by artificial inoculations on cotton seedlings with a completely randomized design. The total of the isolates was characterized as ND. Two strains from La Rioja, two from Catamarca and one from Mendoza, were significantly more virulent (p< 0.05) for the relative area under disease progress curve, final mean severity, average severity percentage and severity index.
Key words: verticillium wilt; pathotype;isolates; severity; olive.
La verticilosis causada por el hongo habitante del suelo Verticillium dahliae Kleb. es una enfermedad que afecta a m�s de 200 especies de plantas dicotiled�neas incluyendo hortalizas, frutales, ornamentales y malezas (Pegg y Brady, 2002). En el cultivo del olivo (Olea europea L.) se considera una de las enfermedades de mayor impacto, tanto por las elevadas p�rdidas econ�micas que ocasiona como por las dificultades que implica su control qu�mico (Jim�nez D�az etal., 2012).
La enfermedad en este cultivo fue identificada por primera vez en Argentina en el norte de la provincia de C�rdoba por Docampo, V�zquez y Laguna (1981) y posteriormente ha sido detectada en las provincias de La Rioja, Catamarca y Mendoza (Roca et al., 2001; Otero, 2005; Roca, 2015).
Aunque la incidencia de la enfermedad no ha sido determinada en todas ellas, un estudio realizado en huertos tradicionales de m�s de 25 a�os del cultivar Arauco en el departamento hom�nimo de la provincia de La Rioja revel� que su valor era del 3,1 %, y que vari� entre el 0 y 9 % seg�n el distrito considerado (Ladux, Jotayan, Otero, Gonz�lez y Ortiz, 2014). Otro estudio realizado por Roca (2015) en un huerto de la variedad Picual revel� un incremento de la incidencia de seis veces en tan solo cuatro a�os, lo que demostr� que la incidencia de la enfermedad var�a con el cultivar, la densidad del in�culo y las condiciones ambientales, en particular las pr�cticas culturales.
Verticillium dahliae se reproduce asexualmente por medio de la producci�n de conidios sobre conidi�foros verticilados y presenta formas de resistencia denominadas microesclerocios, que permiten al pat�geno sobrevivir en el suelo durante largos per�odos de tiempo (Blanco L�pez, Rodr�guez Jurado y Jim�nez D�az, 1994). Al germinar los microesclerocios inician la infecci�n de la planta a trav�s de las ra�ces y, si bien la penetraci�n puede ser directa, es favorecida por la presencia de heridas en estos �rganos. Luego, el hongo se sistematiza en la planta a trav�s del xilema (Rodr�guez Jurado, 1993; Ba�dez, G�mez, del R�o y Ortu�o, 2007).
Los factores m�s importantes que determinan el desarrollo de la verticilosis son la virulencia del patotipo de V. dahliae que infecta la planta, la densidad de in�culo en el suelo, el genotipo afectado y los efectos ambientales (Blanco L�pez et al., 1994; L�pez Escudero, Nu�ez Santos y Blanco L�pez, 2003). Su conocimiento permite establecer niveles de riesgo y dise�ar estrategias de control previamente a la siembra o plantaci�n (L�pez Escudero et al., 2003).
Estudios previos en los cultivos de olivo como en los de algod�n (Gossypium hirsutum L.), mostraron que los aislados de V dahliae pueden clasificarse en dos tipos: patotipos defoliantes (D) y patotipos no defoliantes (ND), de acuerdo a la capacidad de causar defoliaci�n. Mientras que los patotipos D son altamente virulentos y causan la p�rdida total de hojas y muerte de la planta, los patotipos ND son levemente virulentos y conducen a marchitez sin defoliaci�n (Mercado Blanco, Rodr�guez Jurado, Parrilla Araujo y Jim�nez D�az, 2003; Baytar, Erdogan, Frary y Doganlar, 2017). Debido a estas diferencias es importante determinar el/los patotipo/s presentes en las poblaciones del hongo. A su vez, la correcta identificaci�n de aislados de V. dahliae es importante para una mejor comprensi�n de la epidemiolog�a de la verticilosis y para mejorar la eficiencia en el manejo de la enfermedad en estos cultivos (Schnathorst y Sibbet, 1971; Bejarano Alc�zar, Blanco L�pez, Melero Vara y Jim�nez D�az, 1996) como as� tambi�n para la elecci�n de variedades.
La determinaci�n del patotipo se puede realizar mediante inoculaciones artificiales en hospedantes diferenciales (Schnathorst y Sibbett, 1971) y a trav�s de m�todos microbiol�gicos como el an�lisis del desarrollo de la colonia seg�n temperatura �ptima de crecimiento en medio agar papa glucosado (APG) (Docampo et al, 1981; Otero, 2005), medio APG-sanguinarina (Presley, 1969) o seg�n la morfolog�a de microesclerocios en medio de cultivo selectivo (L�pez Escudero et al., 2003). Estas t�cnicas son un tanto tediosas, insumen tiempo y no siempre arrojan resultados confiables (Bejarano Alc�zar et al., 1996).
Las t�cnicas moleculares basadas en el an�lisis del ADN tienen como ventaja su gran sensibilidad, especificidad y rapidez. En el caso de V dahliae, se han clonado y secuenciado fragmentos de su genoma que han facilitado el dise�o de iniciadores para su detecci�n e identificaci�n por PCR (reacci�n en cadena de la polimerasa) (Nazar, Hu, Schmidt, Culham y Rob, 1991; Morera, P�ez, Vega y Montes, 2005; Otero, 2005). P�rez Artes, Garc�a Pedrajas, Bejarano Alc�zar y Jim�nez D�az (2000) dise�aron cebadores de PCR que diferencian entre los patotipos D y ND de V. dahliae analizando el genoma del hongo. A partir de estos marcadores, con el objetivo de aumentar la sensibilidad en la detecci�n, Mercado Blanco, Rodr�guez Jurado, P�rez Artes y Jim�nez D�az (2001) y Mercado Blanco, Rodr�guez Jurado, P�rez Artes y Jim�nez D�az (2002) dise�aron cebadores internos que permiten mediante la t�cnica de nested-PCR (PCR-anidada) detectar los patotipos mencionados. Estas t�cnicas mostraron efectividad en la discriminaci�n de las cepas de V dahliae a partir de tejidos de tallo y ra�z de plantines de olivos inoculados artificialmente con el pat�geno (Mercado Blanco et al., 2003).
Si bien en Argentina se encuentra distribuido el patotipo ND (Docampo et al., 1981; Otero, 2005), en un estudio realizado por Roca (2015), mediante PCR anidada, se report� la presencia del patotipo D en brindillas de olivo sintom�ticas de la variedad Picual provenientes de la provincia de La Rioja. Aunque se constat� la presencia del patotipo D por t�cnicas moleculares en dicha regi�n, no existen reportes de aislamientos de ese patotipo mediante m�todos microbiol�gicos en el pa�s. Sin embargo, se sospecha que pudiera haber ingresado con material importado para realizar nuevas plantaciones al amparo de la Ley de Diferimiento Impositivo (G�mez del Campo, Morales Sillero, Vita Serman, Rousseaux y Searles, 2010). De aqu� surge la necesidad de continuar con el relevamiento de la verticilosis en huertos de olivo locales. Adem�s, existe una colecci�n de 42 cepas de V. dahliae provenientes de los principales huertos de olivo del pa�s: 55 % de La Rioja, 19 % de Mendoza, 14 % de Catamarca y 12 % de C�rdoba. Se conserva en el Instituto de Patolog�a Vegetal del Centro de Investigaciones Agropecuarias (IPAVE, CIAP) perteneciente al Instituto Nacional de Tecnolog�a Agropecuaria (INTA), y sus cepas a�n no han sido clasificadas de acuerdo a su patotipo.
A campo se han observado distintos niveles de da�o asociados a la verticilosis en plantas de olivo que podr�an deberse a diferencias en la virulencia de las cepas ND predominantes en el suelo. Estudios recientes realizados por Cotton Research and Development Corporation (2017) reportaron la presencia de aislados virulentos de V. dahliae pertenecientes al patotipo ND en el cultivo de algod�n a campo en Australia y posteriormente, en el mismo pa�s, Dadd Daigle et al. (2020) confirmaron las observaciones a campo mediante inoculaciones artificiales en algod�n con aislados virulentos de V. dahliae ND, bajo condiciones controladas.
Teniendo en cuenta la amplia variabilidad patog�nica de las poblaciones de V. dahliae (Blanco L�pez et al., 1994) y que los patotipos ND y D de V. dahliae difieren en agresividad y sintomatolog�a en el cultivo de olivo (Schnathorst y Sibbett, 1971; Rodr�guez Jurado, 1993), resulta necesario a los fines pr�cticos conocer el patotipo al que pertenecen los aislados y su virulencia, informaci�n esencial para aplicar en trabajos de mejoramiento orientados a la selecci�n de cultivares. Tal como sostienen Lachquer y Sedra (2002), la b�squeda e identificaci�n de resistencia requiere conocimientos acerca de la diversidad gen�tica dentro de las poblaciones naturales del pat�geno y sobre las relaciones entre sus aislados.
Dada la sintomatolog�a observada en plantaciones de olivo a campo, se presume que los aislados de V. dahliae presentes en la zona oliv�cola argentina estar�an incluidos dentro del patotipo ND, pudiendo presentar diferencias en su virulencia. Sobre la base de lo mencionado anteriormente los objetivos de este trabajo fueron: determinar el patotipo al que pertenecen los aislados de Verticillium dahliae Kleb. obtenidos de plantas de olivo presentes en las regiones oliv�colas del centro y oeste de Argentina; y evaluar la virulencia en algod�n de ocho aislados de Verticillium dahliae Kleb. representativos de las �reas oliv�colas del centro y oeste de Argentina
Determinaci�n de los patotipos de V dahliae mediante PCR anidada con el uso de cebadores espec�ficos
Aislados de V. dahliae
Se analizaron 42 aislados de V. dahliae pertenecientes a la colecci�n existente en el IPAVE provenientes de plantas sintom�ticas, 8 de los cuales fueron recolectados en prospecciones recientes en la regi�n centro y oeste de la Argentina. Con respecto a estos �ltimos, se realiz� una colecta en �rboles sintom�ticos de huertos de olivo pertenecientes a las provincias de Catamarca (-Ca), C�rdoba (-Co), La Rioja (-LR) y Mendoza (-Mz). Las muestras se tomaron desde inicio de la brotaci�n en primavera (setiembre en adelante) a partir de ramas con s�ntomas de verticilosis durante los a�os 2014, 2015 y 2016. De cada planta se tom� una muestra compuesta por 5 a 10 ramas de 20-30 cm de longitud que fue preservada en bolsa pl�stica para evitar su deshidrataci�n y luego transportada refrigerada al laboratorio donde se mantuvo a 4 �C hasta su procesamiento, dentro de las 24-48 h (Otero, 2005; Roca, 2015).
Para realizar los aislamientos las ramas se lavaron bajo agua corriente de red y se desinfectaron superficialmente por inmersi�n en hipoclorito de sodio al 20 %, durante 20 seg. Se elimin� la corteza en c�mara de flujo laminar y se tomaron peque�as escamas de madera que se sembraron en medio agar papa dextrosa (APD) 2 % (Otero, 2005). Por cada planta, se realizaron 10 placas con 5 a 8 escamas en cada una de ellas. La incubaci�n de los cultivos se realiz� a 24 �C y en oscuridad. Las colonias desarrolladas se identificaron seg�n la descripci�n de Melouk (1992) y se conservaron en tubos con glicerol al 40 % y almacenadas a una temperatura de - 40 �C hasta su utilizaci�n.
Extracci�n de ADN de V. dahliae
Los 42 aislados se cultivaron en placas con medio APD a 24 �C en oscuridad durante 7 d�as. Peque�os discos de agar colonizados por el hongo fueron transferidos a medio caldo papa dextrosa (CPD) y cultivados por 7 d�as en agitaci�n a 150 rpm y 24 �C en oscuridad. El micelio fue filtrado con bomba de vac�o y posteriormente liofilizado. El ADN del hongo se purific� a partir de 100 mg de material liofilizado, seg�n protocolo de Doyle y Doyle (1990) con modificaciones. Se realiz� un doble lavado con cloroformo-alcohol isoam�lico (24:1) en el protocolo de extracci�n. El ADN extra�do se ajust� a una concentraci�n de 20 ng/ul mediante espectrofot�metro (Thermo Scientific NanoDropT 1000 Spectrophotometer).
Determinaci�n de los patotipos de V. dahliae mediante PCR anidada
La detecci�n de patotipos del hongo mediante una PCR anidada, permite detectar al hongo y discriminar entre los patotipos D y ND. Los cebadores NDf/NDr, que amplifican un producto de 1410 pares de bases, y los cebadores INTND2f/ INTND2r, que amplifican un producto de 824 pares de bases, se usaron para identificar el patotipo ND (Mercado Blanco etal., 2001). Para la detecci�n del patotipo D, se emplearon los cebadores D1/D2 e INTD2f/ INTD2r, que amplifican productos de 548 y 462 pares de bases respectivamente (Mercado Blanco et al., 2002). Como controles positivos se incluyeron reacciones con los aislados V4 (ND) y V117(D) provistos por el Dr. M. Blanco L�pez (Universidad de C�rdoba, Espa�a). Los productos de la amplificaci�n por PCR se analizaron por electroforesis, en geles de agarosa 1,5 % a 5 V/cm, por media hora y fueron visualizados bajo UV previa tinci�n con gel red.
Evaluaci�n de la virulencia de V. dahliae en plantines de algod�n
Preparaci�n del in�culo
Para las pruebas de virulencia se utilizaron los ocho aislados de V dalhiae obtenidos en las prospecciones recientes designados con las siglas: 1-Mz, 2-Mz, 3-Mz; 1-LR, 2-LR; 1-Ca, 2-Ca y 1-Co.
Para cada aislado, el in�culo se prepar� sembrando cuatro discos de APD colonizados con el hongo, en Erlenmeyer con medio CPD y puestos en agitaci�n a 125 rpm y 24 �C en oscuridad por 7 d�as. El micelio se filtr� con doble gasa est�ril y la suspensi�n de conidios se cuantific� en c�mara de Neubauer ajust�ndose la concentraci�n con agua est�ril a 1x106 conidios/ml (Zhou et al., 2014).
Inoculaciones artificiales
Para las pruebas de virulencia, se utilizaron plantines de algod�n de dos meses de edad y con tres pares de hojas verdaderas desarrolladas pertenecientes a la variedad Guazuncho 3 INTA que muestra susceptibilidad a V dahliae (Bonacic et al., 2012). Las semillas fueron provistas por la Estaci�n Experimental Agropecuaria S�enz Pe�a, INTA. La siembra se realiz� en macetas pl�sticas de 700 cc con sustrato est�ril suelo-perlita (2:1) bajo condiciones controladas y el riego fue provisto cada dos d�as. Diez plantines fueron inoculados artificialmente a trav�s del m�todo de inmersi�n radicular (Zhou et al., 2014) con cada cepa a trav�s de un dise�o totalmente aleatorizado. Para ello los plantines fueron descalzados de la maceta, sus ra�ces lavadas con agua corriente y sumergidas durante una hora en 300 ml de la suspensi�n de conidios correspondiente a las ocho cepas del hongo. Diez plantines fueron utilizados como controles trat�ndolos con agua est�ril.
Inmediatamente despu�s de la inoculaci�n, todos los plantines fueron trasplantados en macetas pl�sticas de 700 cc en sustrato est�ril suelo-perlita (2:1) y llevados en c�mara de crecimiento bajo condiciones controladas a 24 �C � 5 �C, 12 h de fotoper�odo (216 pE m-2s-1 intensidad lum�nica) y 80 % de humedad relativa, siguiendo a Baytar et al., (2017). Estas condiciones se mantuvieron durante todo el ensayo.
Evaluaci�n de la enfermedad
La severidad de la enfermedad en plantas individuales causada por los ocho aislamientos de V dahliae se evalu� semanalmente durante seis semanas. La gravedad de los s�ntomas en plantas individuales se evalu� en una escala de calificaci�n de 0 - 4 seg�n el porcentaje de follaje afectado de abajo hacia arriba: 0= ausencia de s�ntomas; 1= 1-33 % de clorosis/necrosis de ho�jas; 2= 34-66 % de clorosis/necrosis de hojas; 3= 67-100 % clorosis/necrosis de hojas; y 4= planta muerta siguiendo a Jim�nez Diaz et al. (2017).
Las siguientes variables fueron analizadas para cada aislado junto a los controles: severidad media final (SMF) calculada como el promedio de la severidad seg�n escala de 0-4 al final de la evaluaci�n; porcentaje de severidad media (PSM) calculada como el promedio de la severidad en porcentaje durante todo el per�odo de evaluaci�n, severidad de la enfermedad (SE), e �ndice de severidad (IS) (Kheiri y Fatahi, 2010). La SE se calcul� seg�n la siguiente f�rmula:
Tambi�n se calcul� el porcentaje de incidencia final de la enfermedad (PI) y el porcentaje de mortalidad (PM) de plantines y se estim� el �rea bajo la curva de progreso de la enfermedad relativa (ABCPEr), utilizando su valor porcentual respecto al m�ximo valor que podr�a alcanzarse en el per�odo de evaluaci�n, de acuerdo a la f�rmula de Campbell and Madden (1990):
para el n�mero de observaci�n i, s =valor m�ximo de severidad (4), f = n�mero de d�as entre la inoculaci�n y observaci�n i, te = per�odo total de evaluaci�n, y n = n�mero de observaciones.
La colonizaci�n vascular de las plantas se constat� mediante aislamientos de tejidos extra�dos de pec�olos y tallos a los 20 d�as despu�s de la inoculaci�n en tres plantas sintom�ticas tratadas con la suspensi�n de conidios de cada aislamiento de V dahliae. El mismo estudio se realiz� en tres plantas del tratamiento control (agua est�ril).
An�lisis estad�stico
Los datos de las variables asociadas a la enfermedad de los distintos tratamientos se sometieron a an�lisis de varianza (ANAVA) previa verificaci�n de los supuestos utilizando el software estad�stico InfoStat (Di Rienzo et al., 2019). Las comparaciones a posteriori entre tratamientos se realizaron mediante la prueba LSD de Fisher. En todos los casos se consider� un nivel de significancia de 0,05.
Tabla 1: Descripci�n de los aislados de Verticillium dahliae procedentes de olivares del centro y oeste de Argentina.
Figura 1: Segundo producto de PCR con cebadores INTND2f e INTND2r, de aislamientos de Verticillium dahliae. M: Marcador de peso molecular (100 pb.); L�neas 1-4: La Rioja; 5-7: Catamarca; 8-10: Mendoza; 11-14: C�rdoba; C+: Control positivo (V4), C-: Control negativo (sin ADN). L�neas 1, 7, 8, 9 y 11 se corresponden con los aislados 2-LR, 1-Ca, 1-Mz, 3-Mz y 1-Co respectivamente
Figura 2: S�ntomas en plantines de algod�n susceptibles de tres meses de edad a los 30 d�as de inoculados con una suspensi�n de conidios de aislados no defoliantes de Verticillium dahliae. 1-Co, 1-LR, 1-Mz: plantines tratados con aislados de C�rdoba, La Rioja y Mendoza, respectivamente. H2O: plant�n tratado con agua est�ril.
Tabla 2: Variables de la enfermedad en plantines de algod�n inoculados artificialmente con distintos aislados no defoliantes (ND) de Verticillium dahliae
Determinaci�n de los patotipos de V. dahliae mediante el uso de cebadores espec�ficos y PCR anidada
De las prospecciones realizadas recientemente en huertos de olivo del centro y oeste de Argentina se obtuvieron tres aislados de V dahliae rocedentes la provincia de Mendoza (1-Mz, 2-Mz y 3-Mz), dos de Catamarca (1-Ca y 2-Ca), dos de La Rioja (1-Lr y 2-Lr) y uno procedente de C�rdoba (1-Co) (Tabla 1) que junto a los aislados del hongo existentes en el IPAVE constituyen la colecci�n analizada en este estudio.
Las extracciones de ADN a partir de micelio liofilizado de los 42 aislados de V dahliae resultaron adecuadas para las amplificaciones de PCR utilizando ADN diluido a 20 ng/ul. El doble lavado con cloroformo-alcohol isoam�lico (24:1) en el protocolo de extracci�n result� exitoso para la obtenci�n de ADN de calidad.
El tama�o de banda de los aislados de V. dahliae procedentes de olivo, coincidi� con el tama�o de banda del aislado control V4 (ND), tanto en la primera reacci�n de PCR (1410 pb) como en la segunda reacci�n anidada (824 pb), utilizando los cebadores NDf/NDr e INTND2f/INTND2r respectivamente (Figura 1). No se obtuvieron amplificaciones de los aislados con los cebadores D1/D2 e INTD2f/ INTD2r a excepci�n del control V117 (D).
Se observaron amplificaciones en la primera reacci�n de PCR para la mayor�a de las cepas evaluadas y en el 100 % de ellas en la reacci�n anidada. La falta de visualizaci�n de los productos de la primera amplificaci�n concuerda con los resultados presentados por Mercado Blanco et al. (2001) y Mercado Blanco et al. (2002) cuando analizaron plantas de olivo infectadas.
Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran la utilidad de la PCR anidada y de los cebadores espec�ficos para la caracterizaci�n de los distintos patotipos del hongo a partir de micelio. Estos marcadores tambi�n resultaron exitosos en la clasificaci�n de los patotipos de V dahliae aislados de plantas de olivo (Dervis, Mercado Blanco, Erten,
Valverde Corredor y P�rez Art�s, 2010; Al Taae, 2020), y en estudios recientes de evaluaci�n de virulencia en algod�n (Jim�nez Diaz et al., 2017; Dadd Daigle et al., 2020).
El total de los aislados de V dahliae analizados en el presente estudio dieron origen a amplificaciones en coincidencia con el control V4, confirmando que el patotipo ND es el que se encuentra ampliamente difundido en la regi�n olivarera de Argentina en concordancia con lo reportado por Docampo et al. (1981), Otero (2005) y Roca (2015) que detectaron el patotipo ND en las provincias de C�rdoba y La Rioja. Si bien Roca (2015), utilizando los mismos cebadores espec�ficos, detect� la presencia del patotipo D en la provincia de La Rioja, hasta la fecha no se han logrado aislamientos pertenecientes a este patotipo en el pa�s y aunque menos virulento, el patotipo ND constituye una seria amenaza en huertos de olivos (Mercado Blanco et al., 2001).
Evaluaci�n de la virulencia de V. dahliae en plantines de algod�n
Todas las plantas inoculadas artificialmente presentaron s�ntomas caracter�sticos de la enfermedad. �reas clor�ticas irregulares entre las nervaduras principales y sobre los m�rgenes de hojas inferiores dando un aspecto de "moteado", fue el s�ntoma predominante (Figura 2) en concordancia con lo expuesto por Pegg y Brady (2002) y Bonacic et al. (2012). Los primeros s�ntomas comenzaron a partir de los siete d�as despu�s de la inoculaci�n, en el que comenz� la toma de registros. Esto concuerda con lo presentado por Jim�nez D�az et al. (2017) que reportaron el desarrollo de los primeros s�ntomas 7-9 d�as despu�s de la inoculaci�n en pruebas de virulencia de V dahliae en algod�n a partir de inoculaciones artificiales.
El m�todo de inmersi�n radicular de plantines de algod�n en condiciones controladas fue exitoso en concordancia con estudios de evaluaci�n de virulencia de V dahliae (Dadd-Daigle et al., 2020). Esta metodolog�a, tal como afirman Devey y Rosielle (1986), permite eliminar o minimizar la influencia de factores ambientales, ahorrar espacio y acelerar el proceso de evaluaci�n de enfermedades.
Se obtuvieron aislados de V dahliae a partir de hoja y tallo en todos los tratamientos inoculados con el hongo, confirmando de esta manera la infecci�n. En las plantas tratadas con agua no se observaron s�ntomas asociados a la enfermedad, ni se obtuvieron aislados del hongo. La determinaci�n del porcentaje de hojas infectadas result� una metodolog�a objetiva en concordancia con lo expuesto por Zhou et al., (2014) que, aunque es un proceso laborioso, posibilita cuantificar con precisi�n la respuesta de las plantas a la verticilosis.
Los aislados 1-Mz, 1-LR, 2-LR, 1-Ca y 2-Ca provocaron significativamente (p< 0,05) mayor SMF, PSM, IS de la enfermedad y ABCPEr con respecto al resto de los tratamientos seg�n se desprende del ANAVA (Tabla 2). Estos resultados concuerdan con los presentados por Dadd Daigle et al. (2020) que tambi�n observaron diferencias significativas en la SMF y en ABEPE (�rea bajo la "escalera" de progreso de la enfermedad) de plantines de algod�n inoculados artificialmente por inmersi�n radicular con aislados ND de V dahliae. Jim�nez D�az et al. (2017) tambi�n observaron diferencias significativas en la SMF y ABCPEe �rea bajo la curva de progreso de la enfermedad estandarizada) en pruebas de virulencia en algod�n con patotipos ND de V dahliae. Cirulli, Colella, D'Amico, Amenduni y Bubici (2008) utilizaron dos aislados ND en inoculaciones artificiales de olivo, tanto para una variedad susceptible (Leccino) como dos tolerantes (Frantoio y Coratina) y no observaron diferencias estad�sticamente significativas en la severidad de la enfermedad. Esto podr�a deberse a que en olivo los s�ntomas de verticilosis son menos evidentes que los observados en otros hospedadores susceptibles a V dahliae (Schnathorst y Sibbett, 1971) y que la utilizaci�n de dos aislados podr�a resultar escasa para la observaci�n de diferencias en las distintas variables de la enfermedad.
No se observ� defoliaci�n en ninguna planta inoculada con el hongo. Esto concuerda con los resultados presentados por Dadd Daigle et al. (2020) que tampoco observaron defoliaci�n en pruebas de virulencia de patotipos ND de V. dahliae en algod�n. Jim�nez D�az et al. (2017) por su parte reportaron s�lo un aislado ND que caus� defoliaci�n de las hojas m�s bajas de plantines de algod�n en evaluaciones de virulencia del hongo.
La mortalidad fue del 20 % para la cepa 1-Mz y 10 % para 1-LR, por lo que resultan los aislados m�s virulentos. La mortalidad fue nula para el resto de los aislados y el tratamiento control en el marco del presente estudio. Dadd Daigle et al. (2020) reportaron mortalidad s�lo en plantines inoculados con aislados D y un aislado virulento ND de V. dahliae.
El PI fue del 100 % en todos los tratamientos (Tabla 2) con excepci�n de las plantas inoculadas con la cepa originaria de C�rdoba que alcanz� un PI de 90 %. Si bien la cepa 1-Co provoc� valores m�s bajos para las variables SMF, PSM, IS de la enfermedad y ABCPEr, el PI no result� una variable beneficiosa a la hora de evaluar la virulencia de las distintas cepas en condiciones controladas, en concordancia con los resultados presentados por Jim�nez D�az et al. (2017) que obtuvieron porcentajes de incidencia del 100 % en ensayos de virulencia de aislados D y ND de V dahliae en algod�n.
Los resultados de este estudio indican que las distintas cepas ND de V dahliae aisladas de plantas de olivo utilizadas en esta investigaci�n poseen distinto grado de virulencia en algod�n. Las cepas 1-Mz, 1-LR, 2-LR, 1-Ca y 2-Ca fueron m�s virulentas que las cepas 2-Mz, 3-Mz y 1-Co para las variables analizadas. Estos resultados deben confirmarse con futuros estudios en plantas de olivo ya que los patotipos virulentos ND del hongo podr�an representar una amenaza para los huertos locales.
Los ensayos de evaluaci�n de virulencia en algod�n de cepas de V dahliae provenientes de olivos enfermos, junto a las pruebas de PCR para caracterizar los patotipos ND o D contribuyen al estudio de la biolog�a poblacional de V dahliae y al desarrollo de estrategias de manejo para controlar esta enfermedad. En particular, dada la patogenicidad cruzada de los patotipos de V dahliae entre olivo y algod�n (Schnathorst y Sibbet, 1971), los resultados del trabajo aportan informaci�n para la selecci�n de cepas de mayor agresividad que podr�an ser utilizadas en pruebas de comportamiento varietal en olivo. Esto tiene aplicaci�n en ensayos orientados a la obtenci�n de materiales resistentes a V dahliae, principalmente a un determinado patotipo presente en una regi�n, un objetivo de muchos programas de mejoramiento.
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