variabilidad del acervo génico y ParámetroS

germinativoS en PoblacioneS naturaleS de

enterolobium contortiSiliquum (leguminoSae) del

noreSte argentino

gene Pool variability and germinative ParameterS in natural

PoPulationS of enterolobium contortiSiliquum (leguminoSae) from

northeaStern argentina

1,4

1,2,3

, Alejandra L. Goncalves

Carla G. Martinotto

, María E. Barrandeguy

1,2,3

&

María V. García

*

Summary

Background and aims: Enterolobium contortisiliquum is a SouthAmerican native forest

tree. Gene pool variability and germinate variables were estimated in populations from

Northeastern Argentina in order to analyze the relationship among gene ﬂow, mating

system, and dispersal.

1

. Universidad Nacional de

Misiones. Facultad de Ciencias

Exactas, Químicas y Naturales.

Posadas, Misiones, Argentina

2

-

M&M: Individuals from Eldorado and Ituzaingó populations and seeds from Ituzaingó

were genotyped by means of ﬁve and four nuclear microsatellite loci, respectively.

Germinate variables were determined while genetic diversity and population structure

were characterized. Indirect gene ﬂow and pollen-mediated gene ﬂow were estimated.

Nuclear genetic variability diﬀerentiation at locus and gene pool levels was determined.

Results: The analyzed populations showed high genetic diversity. At least one or two

pollen donor trees by fruit were detected. Also, the absence of population genetic

structure as a consequence of high pollen and seed-mediated gene ﬂow was detected.

The seeds showed the highest genetic diﬀerentiation at locus and gene pool levels.

Conclusions: The high gene ﬂow levels detected contribute to maintaining the gene pool

variability while the high genetic diversity, the absence of both inbreeding and population

genetic structure together with pollen-mediated gene ﬂow support allogamy as the main

mating system in the analyzed populations.

3

Investigaciones Científicas

Técnicas (CONICET - Argentina).

4

Labardén 200, San Isidro, Buenos

Aires, Argentina.

*vgarcia@fceqyn.unam.edu.ar

MARTINOTTO, C. G., M. E.

BARRANDEGUY, A. L. GONCALVES

&

Key wordS

del acervo génico y parámetros

germinativos en poblaciones

naturales de Enterolobium

contortisiliquum (Leguminosae) del

Noreste Argentino. Bol. Soc. Argent.

Bot. 57: 751-768.

Genetic structure, genetic variability, germination, microsatellites, pollen donors, timbó.

reSumen

Introducción y objetivos: Enterolobium contortisiliquum constituye un recurso forestal

nativo sudamericano. En el presente trabajo se estimó la variabilidad del acervo génico

y se evaluaron variables germinativas en poblaciones del Noreste argentino de esta

especie para analizar la relación entre el ﬂujo génico, el sistema de fecundación y la

dispersión.

M&M: Se genotipiﬁcaron individuos de las poblaciones Eldorado e Ituzaingó y semillas

de Ituzaingó mediante cinco y cuatro loci microsatélites nucleares, respectivamente. Se

determinaron variables germinativas, se caracterizó la diversidad genética y la estructura

genética poblacional, se estimaron los niveles de ﬂujo génico de manera indirecta, se

identiﬁcó la presencia de alelos heredados vía polen y se determinó la representatividad

de la variabilidad genética nuclear a nivel de locus y de acervo génico.

DOI: https://doi.

org/10.31055/1851.2372.v57.

n4.38230

Resultados: Las poblaciones analizadas presentaron elevada diversidad genética. Se

detectó el aporte, como mínimo, de uno o dos árboles donantes de polen por fruto y

ausencia de estructura genética poblacional como consecuencia de elevados niveles

de ﬂujo génico mediado por polen y semillas. Las semillas presentaron la mayor

diferenciación respecto a su complemento tanto a nivel de locus como de acervo génico.

Conclusiones: Los elevados niveles de ﬂujo génico detectados contribuyen al

mantenimiento de la variabilidad del acervo génico mientras que, la detección de

elevados niveles de diversidad genética, valores nulos del coeﬁciente de endogamia,

ausencia de estructura genética y alelos heredados vía polen a partir de una fuente

externa a las poblaciones estudiadas, respaldan que la alogamia es el sistema de

fecundación dominante en ellas.

Recibido: 12 May 2022

Aceptado: 23 Ago 2022

Publicado impreso: 30 Dic 2022

Editora: D. Alejandra Lambaré

PalabraS clave

Donantes de polen, estructura genética, germinación, microsatélites, timbó, variabilidad

ISSN versión impresa 0373-580X

ISSN versión on-line 1851-2372

genética.

751

Bol. Soc. Argent. Bot. 57 (4) 2022

introducción

Estacionales Neotropicales de Sudamérica –

BSEN – (Prado, 2000). Es abundante en las Selvas

El conocimiento de los procesos que conﬁguran de Transición de la Provincia Fitogeográﬁca de las

la diversidad genética poblacional a lo largo de Yungas (Cabrera, 1976), consideradas como parte

las generaciones constituye uno de los aspectos del Núcleo Pedemontano de los BSEN (Prado,

fundamentales en el manejo sostenible de los 2000). Es común en las Selvas Marginales de la

recursos genético-forestales. En ecosistemas Provincia Fitogeográﬁca Paranaense (Cabrera,

boscosos fragmentados, la pérdida de diversidad 1976), unidad perteneciente al Núcleo Misiones

genética en poblaciones aisladas de especies de los BSEN (Prado, 2000). También ocurre en

forestales se produce a una tasa mayor que en bosques en galería dentro de la Provincia Chaqueña

poblaciones continuas (Sork & Smouse, 2006). (Cabrera, 1976) que se corresponden a los llamados

Sin embargo, las poblaciones de especies leñosas Bosques de Transición Austro-Brasileños del

que presentan polinización mediada por animales Núcleo Misiones (Prado, 1993), donde crece sobre

pueden resultar menos susceptibles a los efectos llanuras aluviales de los principales ríos (Morello

de la fragmentación del hábitat (Breed et al., & Adámoli, 1974). Se trata de árboles de fuste

2

015) lo cual, sumado a características tales recto y tronco de hasta 30 m de altura y 1,60 m

como la longevidad de los individuos, la elevada de diámetro en las formaciones densas (Fig. 1A),

diversidad genética dentro de las poblaciones siendo sus hojas alternas y bipinnadas (Tortorelli,

y las posibles tasas elevadas de flujo génico 2009; Hoc et al., 2015) (Fig. 1B). Sus ﬂores son

mediado por polen, confieren a las especies blancas, a veces algo verdosas y se disponen en

forestales la capacidad de hacer frente a las un racimo doble piramidal. Cuando se produce la

consecuencias negativas de la fragmentación antesis se distinguen dos morfos ﬂorales: ﬂores

(

Andrianoelina et al., 2009). En especies forestales perfectas (donantes y receptoras de polen) y ﬂores

con elevados niveles de ﬂujo génico mediado estaminadas (donantes de polen), presentando

por polen, los límites de una población no son ambos morfos las anteras abiertas con políadas

sencillos de ser identiﬁcados, dado que cualquier expuestas y un nectario anular prominente en

individuo que aporte polen a la población se la base del tubo estaminal (Fig. 1C). De esta

convertirá en miembro de la misma, siendo el manera, la inﬂorescencia constituye una unidad

tamaño poblacional potencialmente mayor que de atracción de polinizadores tales como abejas

el representado por el conjunto de árboles del de tamaño mediano (Hoc et al., 2015) y polillas,

cual se puedan colectar semillas (Hattemer, las cuales pueden transportar grandes cargas

2

005). Esta característica de las poblaciones de de polen, visitar inﬂorescencias de un elevado

especies forestales demanda inferir el número de número de árboles y cubrir grandes distancias

posibles donantes de polen que contribuyen al (Moreira et al. 2015). Los frutos son de tipo

acervo génico poblacional mediante el análisis de legumbre bacoide, simples, secos, de color negro

estadios tempranos (semillas). De esta manera, en la madurez, indehiscentes y polispérmicos,

el análisis de la variabilidad genética de los presentando en promedio entre 12 y 15 semillas

individuos adultos y de los posibles donantes de (Fig. 1D). Las semillas son aplanadas y oblongas,

polen mediante el análisis de las semillas permite con testa lisa, córnea, bicolor, glabra, poco pulida

establecer la contribución relativa de cada uno de a opaca, de color marrón oscuro (Barretto &

estos estadios al acervo génico de la población en Ferreira, 2011) (Fig. 1E). Los frutos constituyen

estudio, ya que la estimación de su variabilidad la unidad de dispersión tanto vía endozoocoria,

genética brinda información de utilidad para la mediante la intervención de mamíferos silvestres

sostenibilidad de los recursos genéticos a través y domésticos, que ingieren y deponen grupos de

del tiempo (Gillet et al., 2005).

semillas (Abraham de Noir et al., 2002), como

Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong, vía hidrocoria, principalmente en bosques en

“

timbó”, “oreja de negro” o “pacará”, es la galería asociados a ríos o en relieves con pendiente

única especie del género presente en Argentina. que favorecen el movimiento de los propágulos

Su distribución geográﬁca es disyunta y está (Gentry, 1993; Hunter, 1989).

fuertemente asociada a los Bosques Secos

Los estudios genético-poblacionales que

752

C. G. Martinotto et al. - Variabilidad genética y germinación de Enterolobium contortisiliquum

Fig. 1. Características morfológicas de Enterolobium contortisiliquum. A: Individuo adulto y detalle de la

corteza; B: Hoja compuesta bipinnada; C: Inﬂorescencia; D: Fruto; E: Semillas. Escala= A: 1 m; B-D: 1

cm; E: 0,5 cm. Imágenes de propia autoría y adaptadas de Ilustraciones de Museo Botánico (FCEFyN

-

UNC), de Flora Argentina, Plantas Vasculares de la República Argentina (www.ﬂoraargentina.edu.ar )

y de Argentina nativa (https://faunayﬂoradelargentinanativa.blogspot.com/2011/02/timbo-enterolobium-

contorstiilquum.html).

incluyen variables asociadas a la germinación forestales nativas, en las cuales la dormición

y al establecimiento de las plántulas aportan de las semillas es una característica frecuente.

información relevante para el manejo sostenible La dormición física de las semillas de E.

y la conservación de las poblaciones de especies contortisiliquumseproduceporlaimpermeabilidad

753

Bol. Soc. Argent. Bot. 57 (4) 2022

del tegumento (Abraham de Noir et al., 2002), provenientes de dos poblaciones naturales del

con lo cual, tratamientos pre-germinativos de Noreste argentino con el objeto de determinar

escariﬁcación pueden ser utilizados para inducir variables germinativas, caracterizar la variabilidad

la germinación, simulando procesos que ocurren genética de los diferentes estadios, determinar

de manera natural, como por ejemplo el recorrido la estructura genética y la representatividad de

de las semillas por el tracto digestivo de los la diversidad genética poblacional y estimar

mamíferos (Alexandre et al., 2009). Los estudios de manera indirecta el flujo génico entre las

de germinación son relevantes para evaluar los poblaciones estudiadas.

efectos de los cambios en el uso del suelo sobre la

permanencia de las poblaciones. Ha sido descripto

que los frutos de E. cyclocarpum provenientes de materialeS y métodoS

árboles que habitan áreas de pasturas producen

en promedio un menor número de semillas, las Sistema de estudio

cuales a su vez presentan menor vigor, que los

El área de estudio se situó en el Noreste argentino

frutos de árboles de bosques continuos de los en la Provincia Fitogeográﬁca Paranaense del

BSEN, en los que se ha registrado un menor dominio Amazónico (Cabrera, 1971; Cabrera,

tiempo de germinación de semillas (Rocha & 1976). En esta región, se analizaron individuos

Aguilar, 2001a). Del mismo modo, estudios de la localidad Eldorado, ubicada en el Noroeste

recientes en E. contortisiliqumm revelaron que de la provincia de Misiones, y de la localidad

el tiempo de germinación es afectado por el Ituzaingó ubicada en el Noreste de la provincia

disturbio del hábitat, detectando un tiempo medio de Corrientes (Fig. 2). La distancia lineal que

de germinación menor en áreas preservadas de los separa ambas poblaciones es de aproximadamente

BSEN en relación a áreas con impacto antrópico 250km. Los individuos fueron geo-referenciados

(

Moreira et al., 2021). mediante el sistema de posicionamiento global

Diferentes estudios genético-poblacionales (GPS) mediante un receptor Garmin eTrex® 20×

desarrolladosenpoblacionesdeE.contortisiliquum (precisión de ± 3m). Se analizó material vegetativo

localizadas en Brasil central han detectado de 28 individuos adultos de E. contortisiliquum

diversidad genética elevada mediante el empleo (18 individuos de Eldorado y 10 de Ituzaingó),

de marcadores microsatélites nucleares (SSRnu) como así también tejido embrionario radicular

y estructura genética poblacional moderada obtenido desde tres semillas de dos frutos maduros

empleando marcadores ISSR, la cual ha sido cosechados a partir de cinco árboles madre de

explicada como consecuencia de la presencia de Ituzaingó. Se uniﬁcó el material procedente de

barreras geográﬁcas que limitarían el ﬂujo génico tres semillas por fruto a los efectos de contar con

(

Moreira et al., 2012; Moreira et al., 2015). un volumen de tejido adecuado para la extracción

En el presente trabajo, la estimación de la de ADN.

variabilidad genética intra e interpoblacional y

la evaluación de variables germinativas de E. Análisis de variables germinativas

contortisiliquum en poblaciones del Noreste

Se extrajeron las semillas de los frutos maduros

argentino permitió analizar la relación entre el ﬂujo colectados en Ituzaingó y se registró el número

génico, el sistema de fecundación y la dispersión. de semillas por fruto descartándose las semillas

Atendiendo tanto a la biología reproductiva de vanas y/o dañadas. Las semillas viables fueron

la especie como a la limitada movilidad de los almacenadas a temperatura ambiente en bolsas de

propágulos, que incluye dispersión de semillas papel al resguardo de la humedad y la luz hasta el

por endozoocoria y polinización mediada por establecimiento de los ensayos de germinación.

insectos, la hipótesis de este trabajo plantea que

Se establecieron sendos ensayos de germinación

las poblaciones analizadas presentan estructura a partir de semillas con y sin tratamiento pre-

genética poblacional como consecuencia de ﬂujo germinativo. El ensayo con semillas pre-tratadas

génico restringido.Así, para analizar la variabilidad se estableció a partir de semillas sometidas a

del acervo génico de E. contortisiliquum se escariﬁcación mecánica empleando papel de lija,

consideraron individuos adultos y semillas mediante el cual las semillas fueron pulidas en

754

C. G. Martinotto et al. - Variabilidad genética y germinación de Enterolobium contortisiliquum

Fig. 2. Localización geográﬁca de las poblaciones de Enterolobium contortisiliquum analizadas.

el área opuesta al embrión hasta dejar expuesto el i-ésimo tiempo y N el número total de semillas

el cotiledón. Los ensayos se llevaron a cabo a en cada unidad experimental, es decir semillas

temperatura ambiente (entre 22 y 26°C) y un con y sin tratamiento pre-germinativo. Tiempo

fotoperíodo de 12h según lo recomendado por medio de germinación (t): se calcula como la

Lozano et al. (2016). Se registró el número de media ponderada del tiempo de germinación

semillas germinadas por árbol madre mediante (hora, día u otra unidad de tiempo):

observaciones diarias siguiendo como criterio

de germinación la emergencia radicular (Lozano

et al., 2016). Los ensayos se mantuvieron hasta

cinco días después de observar el último evento

de germinación, es decir hasta que la totalidad de dondet eseltiempodesdeeliniciodelexperimento

i

los tratamientos alcanzó un número constante de a la i-ésima observación; es el número de

semillas germinadas según lo recomendado por semillas germinadas en el i-ésimo tiempo y k

Cruz-Silva & Rosa (2011).

corresponde a la última observación. Coeﬁciente

Para cada árbol madre se consideraron variables de variación del tiempo de germinación (CV ):

t

germinativas mediante la estimación de los indica la uniformidad de la germinación o la

siguientes parámetros propuestos por Lozano-Isla variabilidad en relación con el tiempo medio de

et al. (2019): Germinabilidad (G): porcentaje de germinación:

semillas que completan el proceso de germinación:

G=

100

donde S es la desviación estándar del tiempo de

t

donde n , es el número de semillas germinadas en germinación. Tasa media de germinación: (v):

i

755

Bol. Soc. Argent. Bot. 57 (4) 2022

corresponde al recíproco del tiempo medio de cada dNTP; 1U de Taq polimerasa; entre 0,33-0,60µM

germinación:

del cebador reverse, entre 0,20-0,40µM del cebador

forward en función del locus analizado y 0,2 µM del

Índice de sincronización (Z): corresponde al grado cebador universal M13 marcado con un ﬂuoróforo

de superposición en el tiempo de germinación:

(FAM o HEX) en su extremo 5´.

La genotipiﬁcación de los individuos y del tejido

embrionario se realizó mediante el método de los tres

cebadores propuesto por Schuelke (2000) modiﬁcado

por Goncalves et al. (2013). La genotipiﬁcación

de los amplicones se llevó a cabo por medio de

electroforesis capilar en un secuenciador automático

ABI 3730 XL (Macrogen, Inc., Corea del Sur)

siendo:

y

donde C_n₁_,₂es la combinación de semillas empleando el marcador de peso estándar GS500-

TM

germinadas en el i-ésimo tiempo. La sincronía de ROX (Applied Biosystems®). Los diferentes alelos

germinación de una semilla con otra supone Z=1. fueron identiﬁcados y codiﬁcados a partir del tamaño

Índice de incertidumbre (U): esta medida es una de los fragmentos usando el programa Peak Scanner

adaptación del índice de Shannon y mide el grado 1.0 (Applied Biosystems®).

de incertidumbre asociado a la distribución de la

frecuencia relativa de germinación:

La ampliﬁcación se realizó en dos etapas: 35

ciclos empleando la temperatura de hibridación (T_A)

especíﬁca de los cebadores SSRnu y ocho ciclos

empleando la T del cebador universal M13. Las

A

siendo

reacciones de ampliﬁcación fueron realizadas en un

termociclador con gradiente de temperatura (Biometra

TProfessional Standard) a temperatura de hibridación

donde f corresponde a la frecuencia relativa de ﬁja de 54°C para los loci Ency-24 y Ency-33, de 56°C

i

germinación, al número de semillas germinadas en el para los loci Ency-4 y Ency-17 y de 58°C para el locus

i-ésimo tiempo y k al último día de germinación. La Ency-8.

comparación múltiple de medias de los parámetros

La diversidad genética se caracterizó mediante

de germinación de semillas se realizó empleando la la estimación de los siguientes parámetros:

prueba Student-Newman-Keuls (SNK) con un nivel Frecuencias alélicas por locus, Número promedio

de signiﬁcancia estadística p < 0,05. Las estimaciones de alelos por locus (N ), Número efectivo de

A

se realizaron empleando el paquete de R GerminaR alelos por locus (N ), Número promedio de alelos

E

mediante la aplicación web GerminaQuant for R únicos (N_A_U), Heterocigosis observada (H ) y

O

(Lozano-Isla et al., 2019).

Heterocigosis esperada (H ) calculada como:

E

Análisis de variables genéticas

Los individuos adultos de ambas poblaciones donde x corresponde a las frecuencias alélicas

i

fueron genotipificados empleando cinco loci (Nei, 1987). Estas estimaciones se realizaron

microsatélites nucleares (SSRnu) específicos de empleando el programa GenAlEx versión 6.5

Enterolobium cyclocarpum (Jacq.) Griseb.: Ency-4, (Peakall & Smouse, 2012). Las estimaciones

Ency-8, Ency-17, Ency-24, Ency-33 (Peters et al., de riqueza alélica permiten independizar a las

2008), transferidos a E. contortisiliquum por Moreira estimaciones de números de alelos del sesgo que

et al. (2012), mientras que el tejido embrionario fue puede introducir el tamaño de la muestra (Gillet

genotipiﬁcado empleando cuatro de estos SSRnu et al., 2005). Por ello, se estimaron los siguientes

(Ency-4, Ency-8, Ency-24 y Ency-33), debido a la parámetros: Riqueza alélica (R) y Riqueza de

elevada proporción de datos perdidos en el locus Ency- alelos únicos (R ) (Gillet et al., 2005). Estas

AU

1

7. Las reacciones de ampliﬁcación se realizaron en estimaciones se realizaron empleando el programa

un volumen ﬁnal de 14μl empleando 0,5ng/µl deADN ADZE versión 1.0 (Szpiech et al., 2008).

genómico; 1X de buﬀer KCl; entre 1,12-1,40mM de La fuente de polen fue identiﬁcada considerando

MgCl en función del locus analizado; 1,25mM de los alelos presentes en tres semillas de cada

2

756

C. G. Martinotto et al. - Variabilidad genética y germinación de Enterolobium contortisiliquum

fruto y los genotipos multilocus de cada árbol agrupamiento espacial de individuos incorporando

madre. Este enfoque implica la inferencia de los al agrupamiento no espacial el término

alelos heredados por vía paterna directamente correspondiente a la probabilidad a priori de

desde la detección de alelos por cada fruto y su la posición geográﬁca de cada individuo. Para

comparación con los genotipos maternos (Godoy determinar el número de clusters que presenta

&

Jordano, 2001). Debido a que el material la mayor probabilidad a posteriori se testaron

empleado para la extracción de ADN genómico valores de K clusters comprendidos en un rango de

total fue tejido embrionario proveniente de tres uno a seis (K = [1-6]) realizando 10 repeticiones

semillas del mismo fruto podrían ser detectados para cada valor de K. Este análisis se realizó

más de dos alelos por locus. Así, se espera detectar empleando el programa TESS (Chen et al., 2007;

por fruto, como mínimo, un alelo por locus Durand et al., 2009).

(

árboles madre homocigotas autofecundadas o

La representatividad de la diversidad genética

con donantes de polen genotípicamente idénticos nuclear fue estimada a partir de la diferencia entre

al árbol madre) y como máximo cinco alelos por la composición genética de cada población y de

locus (árbol madre heterocigota con donantes de las semillas en relación a la composición genética

polen genotípicamente diferentes al árbol madre).

de su complemento mediante la estimación del

El grado de estructura genética poblacional índice de diferenciación genética de Gregorius

se analizó mediante el índice de fijación F_S_T(Gregorius, 1984). Además, se estimó el índice

(

Wright, 1965), el cual fue estimado a partir de de diferenciación subpoblacional (δ) para

un análisis de varianza molecular (AMOVA) representar el nivel medio de diferenciación

testando la hipótesis nula de ausencia de estructura entre las poblaciones y las semillas (Gregorius &

genética (Stewart & Excoﬃer, 1996). Este análisis Roberds, 1986). De esta manera, se caracterizó

fue realizado de manera global empleando cada sitio de muestreo y las semillas mediante la

dos modelos definidos atendiendo diferentes diferencia entre su composición genética y la de su

niveles de subdivisión jerárquica para analizar la complemento, considerando como nivel de análisis

distribución de la variabilidad genética: Modelo al acervo génico en el cual los elementos genéticos

1

: Entre poblaciones y entre individuos dentro corresponden a todos los alelos y a nivel de locus

de poblaciones. Modelo 2: Entre poblaciones, considerando los loci SSRnu estudiados en este

entre individuos dentro de poblaciones y dentro trabajo. Para estos análisis se utilizó el programa

de individuos. A partir de este último modelo GSED versión 3.0 (Gillet, 2010). Finalmente,

se estimó el índice para inferir los efectos de el ﬂujo génico (Nm) fue estimado empleando el

la endogamia, es decir del cruzamiento entre método de alelos raros, incluyendo una corrección

individuos más emparentados que la media de la para el tamaño de la muestra implementando el

población (Hartl & Clark, 2007). La signiﬁcancia programa GenePop v 2.4 (Rousset, 2008).

estadística del índice de ﬁjación fue testada con un

valor de p obtenido mediante 1023 permutaciones

de los genotipos dentro y entre poblaciones para reSultadoS

el 95% de conﬁanza (p<0,05). Este análisis fue

desarrollado utilizando el programa Arlequín 3.5 Variables germinativas

(

Excoﬃer & Lischer, 2010). En semillas sin escariﬁcación se evidenciaron

La estructura genética poblacional fue evaluada menores porcentajes de germinación (G entre 0 y

mediante algoritmos de agrupamiento Bayesiano 58%) en relación a los porcentajes registrados en

para determinar el número más probable de semillas con escariﬁcación (G entre 67 y 100%) (F

clusters (K) a los cuales los individuos son = 864,39; p < 0,0001) (Tabla 1). El primer evento

asignados empleando únicamente información de germinación fue detectado a los cinco días y

genética (genotipos multilocus). Para este la última detección fue a los 11 días de iniciado

análisis se empleó un modelo de tipo admixture el ensayo, que se dio por ﬁnalizado luego de

(

admixture ancestry model) implementado en transcurridos cinco días sin detección de eventos

el programa STRUCTURE 2.3.4 (Pritchard et de germinación. En ese intervalo, las semillas

al., 2000). Además, se empleó un modelo de sin tratamiento presentaron mayor frecuencia de

757

Bol. Soc. Argent. Bot. 57 (4) 2022

Tabla 1. Valores medios y desviaciones estándar de los parámetros de germinación de semillas de

Enterolobium contortisiliquum considerando dos tratamientos pre-germinativos: sin escariﬁcación (0); con

escariﬁcación (1). G: Porcentaje de semillas que completan el proceso de germinación; CV:Coeﬁciente

t

de variación del tiempo; Z: Índice de sincronía; U: Índice de incertidumbre; a: ausencia de diferencias

estadísticamente signiﬁcativas entre medias de acuerdo a las pruebas de comparación múltiple de medias SNK.

Tratamiento pre-

germinativo

N° de semillas

germinadas

Árbol

G

CV_t

Z

U

0

1

T21

T22

T23

T24

T25

T28

T29

T21

T22

T23

T24

T25

T28

T29

1

0

4,17

0

14

0

58,33

0

20,48 ± 7,34 a 0,22 ± 0,11 a 1,78 ± 0,58 a

0

1

4,17

0

23

16

24

22

95,83

66,67

100

91,67

11,48 ± 3,45 a 0,35 ± 0,09 a 1,52 ± 0,30 a

9,16 ± 2,48 a 0,48 ± 0,13 a 1,06 ± 0,34 a

10,86 ± 4,24 a 0,44 ± 0,21 a 1,27 ± 0,65 a

15,98 ± 6,34 a 0,35 ± 0,04 a 1,48 ± 0,24 a

17,4 ± 2,45 a 0,39 ± 0,03 a 1,42 ± 0,19 a

15,13 ± 5,85 a 0,30 ± 0,11 a 1,62 ± 0,33 a

12,35 ± 0,72 a 0,54 ± 0,20 a 1,06 ± 0,34 a

germinación en t = 7-9 días, mientras que en las promedio de alelos por locus y número efectivo

semillas con tratamiento pre-germinativo t = 5,38- de alelos en relación a Ituzaingó (Tabla 2). En

6

,75 días (Fig. 3). El coeﬁciente de variación del ambas poblaciones N fue inferior a N indicando

E A

tiempo (CV ) fue bajo tanto para las semillas sin la presencia de alelos a baja frecuencia, en tanto

t

tratamiento pre-germinativo (CV = 20,48) como que N_A_Upresentó valores promedio de 2,20 y

t

para las semillas con tratamiento pre-germinativo 0,80 en Eldorado e Ituzaingó, respectivamente

(

CV = 9,16-17,40), dada la uniformidad en el (Tabla 2). En conjunto, considerando los cinco

t

tiempo de germinación (Tabla 1). La tasa media loci, la heterocigosis observada (H ) fue mayor

O

de velocidad de germinación (v) fue mayor para a la heterocigosis esperada (H ) evidenciando

E

semillas con tratamiento pre-germinativo (Fig. 3). un elevado número de individuos heterocigotas

Se detectó una moderada a baja sincronización (Z) en ambas poblaciones (Tabla 2). La población

y valores bajos de incertidumbre (U) (Tabla 1).

Eldorado presentó mayores valores de diversidad

genética (H =0,51; R=3,38 y R =1,77) que la

E

AU

Variables genéticas

población Ituzaingó (H =0,48; R=3,00 y R =1,39)

E AU

Los cinco loci SSRs analizados resultaron (Tabla 2).

polimórﬁcos. Se detectó un total de 27 alelos

Por su parte, el análisis genético a nivel de

considerando las dos poblaciones estudiadas. El semillas fue realizado desde cinco árboles madre:

número de alelos estuvo comprendido entre 2 y 14 T21, T22, T24, T25 y T29, ya que no fue posible

para los loci Ency-33 y Ency-4, respectivamente obtener ADN de calidad del tejido embrionario

(

Fig. 4). En cuanto a la diversidad genética, la de semillas de los árboles madre T23 y T28.

población Eldorado presentó un mayor número Considerando los cuatro loci en conjunto, se reveló

758

C. G. Martinotto et al. - Variabilidad genética y germinación de Enterolobium contortisiliquum

Fig. 3. Tiempo medio de germinación (t) y Tasa media de velocidad de germinación (v) de siete genotipos

de Enterolobium contortisiliquum considerando semillas con y sin tratamiento pre-germinativo. Las letras

diferentes indican diferencias estadísticamente signiﬁcativas entre medias de acuerdo a las pruebas de

comparación múltiple de medias SNK.

el aporte de, al menos, un donante de polen con el aporte de, al menos, dos árboles donantes de

alelos distintos al árbol madre por fruto (Tabla 3). A polen mediante el registro de hasta tres alelos no

nivel de los frutos del árbol madre T22 se identiﬁcó detectados en el árbol madre por locus (Tabla 3).

759

Bol. Soc. Argent. Bot. 57 (4) 2022

Fig. 4. Frecuencias alélicas por locus en las poblaciones de Enterolobium contortisiliquum estudiadas.

Mediante el análisis de varianza molecular de poblaciones (100%) y en el Modelo 2, dentro

(

AMOVA) en ambos modelos se detectó que el de individuos (100%). A partir del Modelo 2 se

mayor porcentaje de variación estuvo contenido en estimó el índice F el cual presentó un valor de 0

IS

el nivel menos inclusivo: En el Modelo 1, dentro al igual que el índice F , indicando ausencia de

ST

Tabla 2. Caracterización de la diversidad genética en las poblaciones de Enterolobium contortisiliquum

analizadas para los cinco loci SSRs.

Eldorado

N_A_UH_O

Ituzaingó

N_A_UH_O

Locus

N

N_A

N_E

H_E

R

R_A_U

N

N_A

N_E

H_E

R

R_A_U

Ency-4

Ency-8

18

17

11,00 4,50

3,00 2,10

3,00 1,35

4,00 1,86

2,00 2,00

0,88 0,77

0,94 0,52

0,29 0,26

0,61 0,46

1,00 0,50

10

6,00 3,22

2,00 1,92

3,00 1,68

3,00 1,50

2,00 2,00

0,90 0,69

0,80 0,48

0,30 0,40

0,40 0,33

0,80 0,50

10

Ency-17 17

Ency-24 18

Ency-33 18

Media

SE

17,60 4,60 2,36 2,20 0,74 0,51 3,38 1,77 10,00 3,20 2,06 0,80 0,64 0,48 3,00 1,39

0,24 1,63 0,54 1,49 0,13 0,08 0,00 0,73 0,30 0,58 0,12 0,06

Se indica N: tamaño de la población, N : número promedio de alelos por locus, N : número efectivo de alelos

A

E

por locus, N : número promedio de alelos únicos por locus, H : heterocigosis observada, H : heterocigosis

AU

O

E

esperada, R : riqueza alélica, R : riqueza de alelos únicos, SE: Error estándar.

AU

760

C. G. Martinotto et al. - Variabilidad genética y germinación de Enterolobium contortisiliquum

Tabla 3. Genotipos multilocus de los árboles madre y perﬁles alélicos detectados a partir de tejido

embrionario de Enterolobium contortisiliquum por fruto. Se indica: ● Alelos detectados en el árbol madre;

○

Alelos no detectados en el árbol madre.

Árbol T21

Locus Alelos Hojas

Frutos

Árbol T22

Hojas Frutos

Árbol T24

Árbol T25

Frutos

Árbol T29

Hojas Frutos Hojas

Hojas

Frutos

T21 21.1 21.2 T22 22.1 22.2 T24 24.1 24.2 T25 25.1 25.2

T29

29.1 29.2

1

2

83

85

91

98

99

01

●

○

●

○

●

○

●

○

●

○

●

○

Ency-4 202

203

205

207

220

224

225

132

135

149

151

170

222

108

125

128

○

●

○

●

○

●

Ency-8

○

●

○

●

○

●

○

●

○

●

○

●

○

●

○

●

Ency-24 131

140

142

148

●

○

1

12

○

116

120

126

151

159

○

Ency-33

●

○

●

○

●

○

●

○

761

Bol. Soc. Argent. Bot. 57 (4) 2022

Fig. 5. Determinación de la estructura genética poblacional mediante inferencia Bayesiana. A: Inferencia

Bayesiana no espacial; B: Inferencia Bayesiana espacial. Se indica población: Individuos del 1 al 18:

Eldorado; Individuos del 19 al 28: Ituzaingó; C: Determinación de K_m_á_xen base a DIC vs. K.

Fig. 6. Diferenciación genética a nivel de A: acervo génico y B: por locus mediante los marcadores Ency-4,

Ency-8, Ency-24 y Ency-33. El radio correspondiente a la j-ésima subpoblación es proporcional a D, y el ángulo,

j

proporcional al tamaño relativo c se ha igualado para todas las subpoblaciones. El círculo posee un radio

j

proporcional a la diferenciación subpoblacional δ. Se indican Grupos: 1: Eldorado, 2: Ituzaingó y 3: Semillas.

762

C. G. Martinotto et al. - Variabilidad genética y germinación de Enterolobium contortisiliquum

endogamia y de estructura genética poblacional, escariﬁcadas mecánicamente. El porcentaje global

respectivamente. Este último resultado es también de germinación en semillas sin escariﬁcar fue de

respaldado por el modelo no espacial del análisis 10%, en tanto que el de las semillas escariﬁcadas

Bayesiano, el cual no evidenció estructura genética fue de 93%. Estos resultados son similares a los

poblacional (Fig. 5A). Mientras tanto, a partir del informados por Salazar et al. (2000), quienes

análisis Bayesiano espacial, se identiﬁcó K_m_á_xindican que los porcentajes de germinación en

=

2 como número real de clusters genéticos a semillasdeE. contortisiliquumsintratamientopre-

nivel global (Fig. 5C), detectándose una baja germinativo pueden alcanzar hasta 22%, mientras

proporción de admixture o contribución de que en semillas con tratamiento pre-germinativo

diferentes acervos génicos en individuos dentro los porcentajes de germinación varían entre 95

de la población Eldorado y baja o nula estructura

genética poblacional (Fig. 5B).

y 100%. En el presente trabajo se evidenció que

el tratamiento pre-germinativo aplicado no sólo

A nivel de locus, considerando los loci es necesario para romper la dormición de las

Ency-4, Ency-8, Ency-24 y Ency-33 de forma semillas de E. contortisiliquum, sino que también

independiente y a nivel de acervo génico, las acelera el proceso de germinación.

semillas presentaron mayor diferenciación genética

El estudio de la biología reproductiva de

respecto a su complemento. Las poblaciones E. contortisiliquum ha sido abordado en un

Eldorado e Ituzaingó presentaron valores de D_jescaso número de trabajos (Hoc et al., 2015).

menores al índice de diferenciación subpoblacional Moreira et al. (2015) postulan que esta especie

δ (Fig. 6A). Eldorado resultó el sitio con mayor podría presentar fecundación cruzada debido,

representatividad de la diversidad genética a en parte, a estimas previas de heterocigosis que

nivel de los loci Ency-8 y Ency-24, mientras resultaron en H_O> H_Ey H

que a nivel del locus Ency-4 Ituzaingó presentó al., 2012). Estimas similares fueron obtenidas

mayor representatividad. Ambos sitios de muestreo en el presente trabajo (H_O= 0,69; H_E=0,49),

̅

_O=0,66 (Moreira et

̅

presentaron niveles equivalentes de diferenciación evidenciando elevada heterocigosis y diversidad

genética respecto al complemento a nivel del locus genética, así como la presencia de alelos a baja

Ency-33 (D = 0,098) evidenciando la presencia de frecuencia, dado el menor número efectivo

j

alelos compartidos para ese locus (Fig. 6B).

de alelos en relación al número de alelos en

El número efectivo de migrantes estimado ambas poblaciones analizadas. De esta manera,

a partir de la frecuencia de alelos raros en las la diversidad genética detectada podría estar

poblaciones luego de la estandarización del

relacionada con elevadas tasas de fecundación

tamaño de la muestra presentó un valor a nivel cruzada en esta especie, las cuales han sido

global de Nm = 2,70, siendo la frecuencia de alelos evidenciadas mediante la detección de más de un

raros a nivel global p(1) = 0,05.

donante de polen por fruto. Al comparar el perﬁl

alélico de las semillas por fruto con los genotipos

multilocus de los árboles madre se identiﬁcaron

alelos no detectados en cada árbol madre, lo cual

reveló el aporte, como mínimo, de uno o dos

diScuSión

El acervo génico de las poblaciones de E. árboles donantes de polen por fruto. La presencia

contortisiliquum analizadas en el presente de estos alelos identiﬁcados en las semillas podría

trabajo se caracteriza por una elevada diversidad ser consecuencia de un aumento de alelos nuevos

genética, ausencia de estructura genética originados por mutación, o bien incorporación

poblacional y ausencia de endogamia, atributos de alelos a la población por ﬂujo génico reciente

genético-poblacionales que en conjunto pueden mediado por polen a partir de individuos adultos

ser explicados por los elevados niveles de ﬂujo no incluidos en el presente estudio que han

génico, el aporte de múltiples donantes de polen aportado alelos al acervo génico, con lo cual el

y las elevadas tasas de germinación de semillas.

tamaño de las poblaciones de E. contortisiliquum

A partir de las variables de germinación podría ser mayor al considerado, destacando el rol

evaluadas, los valores máximos de porcentaje de los polinizadores tales como las polillas que

de germinación fueron obtenidos en semillas presentan largas distancias de vuelo.

763

Bol. Soc. Argent. Bot. 57 (4) 2022

La distribución de la variabilidad genética entre pueden recorrer varios kilómetros de distancia a

los diferentes niveles jerárquicos se caracterizó través del agua propiciando ﬂujo génico continuo

por un mayor porcentaje de variación contenido y elevado tamaño efectivo poblacional (Imbert et

en el nivel jerárquico menos inclusivo en los dos al., 2003). De esta manera, la dispersión de frutos

modelos empleados, es decir, dentro de poblaciones (y sus semillas) mediada por agua en la época de

y dentro de individuos. Además, se detectó ausencia lluvias y/o por las corrientes de los ríos a lo largo

de estructura genética tanto mediante el índice de de distancias considerables, puede explicar en parte,

ﬁjación (F_S_T= 0) como mediante la implementación la elevada conectividad de las poblaciones (Gentry,

de algoritmos de inferencia Bayesiana, de manera 1993; Hunter, 1989). Estos factores inﬂuyen de

que no se presentan diferencias en las frecuencias manera signiﬁcativa sobre la estructura genética

alélicas entre Eldorado e Ituzaingó. El ﬂujo génico espacial y sobre las tasas de fecundación cruzada

ininterrumpido entre los sitios de muestreo (Nm de especies forestales de los BSEN (Goncalves et

=

2,70) indica que en las poblaciones estudiadas al. 2022), de manera que también inﬂuirían sobre

los efectos del ﬂujo génico son suﬁcientes para la estructura genética y el sistema de fecundación

contrarrestar los efectos de la deriva genética. de poblaciones de E. contortisiliquum distribuidas

SibienenelNoresteargentinolosambientesdonde en estos bosques. Así, el tipo de dispersión de

habita la especie en estudio se ven afectados por el propágulos de E. contortisiliquum podría contribuir

avance de la frontera agrícola y la deforestación, aún en la preservación de una elevada conectividad

se conservan grandes fragmentos de bosques nativos entre sus poblaciones. Considerando los elevados

remanentes, de modo que las poblaciones estudiadas niveles de diversidad genética, así como también

podrían estar interconectadas por ﬂujo génico entre los valores de los índices de endogamia e índices

poblaciones intermedias. El modelo de ﬂujo génico de diferenciación genética detectados en el presente

paso a paso (stepping-stone) entre poblaciones estudio se podría aﬁrmar, en concordancia con

(Slatkin, 1993) explica los patrones de ausencia Moreira et al. (2015), que el sistema de fecundación

de estructura genética en casos en los cuales las de E. contortisiliquum se caracteriza por una

poblaciones se presentan en múltiples parches predominancia de fecundación cruzada de forma

de hábitat con diversos grados de conectividad, similar a lo descripto para E. cyclocarpum (Rocha

determinados en gran medida por el tamaño de los & Aguilar, 2001b). De esta manera, el ﬂujo génico

parches y la distancia geográﬁca que los separa juega un rol fundamental interconectando árboles

(

2

Le Corre & Kremer, 1998; Balkenhol et al., espacialmente distantes o pequeños parches que

016). Ha sido descripta una elevada conectividad actúan como puentes, contribuyendo a la viabilidad

entre poblaciones de E. contortisiliquum como del conjunto de poblaciones, lo cual, sumado a la

consecuencia de la inﬂuencia pasada de la dispersión longevidad de los árboles de esta especie, podría

de frutos mediada por la megafauna extinta, la atenuar las consecuencias genéticas de la creciente

dispersión de semillas por roedores y la dispersión fragmentación del paisaje.

de polen mediada por polinizadores con largas

El conocimiento de la representatividad de

distancias de vuelo (Moreira et al., 2015). Por su la variabilidad genética facilita la identiﬁcación

parte, Hunter (1989) propone que semillas de E. de unidades de conservación de la diversidad

cyclocarpum podrían ser dispersadas por hidrocoria, genética de especies forestales. En cada una de las

debido a que a diferencia de otras especies de la unidades de conservación estará representada una

tribu Mimosoideae las del género Enterolobium fracción de la variabilidad genética de la especie

incluida E. contortisiliquum, presentan vainas y cada una de estas unidades representa un centro

enroscadas sobre sí mismas formando espirales que de diversidad genética (Manel et al., 2003). En

se transportan mejor por el agua que las vainas rectas el análisis de representatividad desarrollado en el

y alargadas. Además, estos frutos no se hunden presente estudio, tanto a nivel de locus como a nivel

en el agua permaneciendo a ﬂote durante varios de acervo génico, las semillas presentaron la mayor

días y se humedecen rápidamente, proporcionando diferenciación respecto a su complemento y, sumado

un ambiente que puede promover la germinación a que ambas poblaciones presentaron elevados

de las semillas (Hunter, 1989). En las especies niveles de diversidad genética y baja diferenciación

ribereñas con dispersión por hidrocoria las semillas genética para los loci analizados, puede postularse

764

C. G. Martinotto et al. - Variabilidad genética y germinación de Enterolobium contortisiliquum

que Eldorado e Ituzaingó podrían ser consideradas agradecimientoS

como posibles unidades de conservación de E.

contortisiliquum en la región.

El presente trabajo constituye parte de la

tesis de grado de CGM para optar al título de

Licenciada en Genética en la Facultad de Ciencias

Exactas, Químicas y Naturales de la Universidad

Nacional de Misiones (FCEQyN – UNaM). El

concluSioneS

Las poblaciones de E. contortisiliquum trabajo fue parcialmente ﬁnanciado con fondos

estudiadas presentan niveles elevados de diversidad correspondientes al Proyecto Especial FCEQyN

genética nuclear siendo Eldorado la población - UNaM A-07: “Caracterización de recursos

que presenta la mayor diversidad. La población ﬁtogenéticos de los campos del sur de Misiones”

Ituzaingó se caracteriza por la contribución, como (Res. CS 1588/15) otorgado a MVG por el Centro

mínimo, de uno o dos donantes de polen por de Investigación y Desarrollo Tecnológico de la

fruto. Las poblaciones no presentan estructura FCEQyN - UNaM. Las autoras agradecen los

genética, como consecuencia de elevados niveles aportes realizados en el proceso de revisión.

de ﬂujo génico mediado por polen y por semillas.

Los elevados niveles de diversidad genética

identiﬁcados, los valores nulos del coeﬁciente de bibliografía

endogamia, la identiﬁcación de alelos heredados vía

polen y la ausencia de estructura genética sustentan ABRAHAM DE NOIR, F., S. BRAVO & R. ABDALA.

la alogamia como el sistema de fecundación

dominante en las poblaciones estudiadas. En

cuanto a la variabilidad genética en las semillas,

un aumento de alelos nuevos originados por

ﬂujo génico a larga distancia mediado por polen

explicarían la mayor diferenciación respecto a

su complemento a nivel de locus y a nivel de

acervo génico. De esta manera, la ausencia de

estructura genética detectada queda explicada por

los elevados niveles de ﬂujo génico mediado por

2002. Mecanismos de dispersión de algunas especies

de leñosas nativas del chaco occidental y serrano.

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manuscrito final; ALG: Colecta del material,

Análisis de los datos, Redacción, revisión y edición

del manuscrito ﬁnal; MVG: Conceptualización,

Colecta del material, Metodología, Adquisición de

fondos, Administración del proyecto, Redacción,

revisión y edición del manuscrito ﬁnal.

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