el SiStema genético de PaSPalum lilloi (Poaceae),  
eSPecie endémica de laS catarataS del iguazú  
the genetic SyStem of PaSPalum lilloi (Poaceae), an endemic SPecieS  
from catarataS del iguazú  
1
,3  
1
2
Anna Verena Reutemann  
, Eric J. Martinez , Gabriel H. Rua  
,
1
3
3
y Ana I. Honfi *  
Mara Schedler , Julio R. Daviña  
Summary  
Background and aims: Paspalum lilloi (Poaceae) is a diploid species, endemic of  
Iguazú Waterfalls and nearby areas. The reproductive biology and current geographical  
distribution of this species are poorly known. The aims of this work were to determine  
the genetic system and to delimit the endemism area and conservation status of the  
species.  
M&M: The genetic system was determined by cytoembryological analysis of ovules,  
viability and in vivo germination of pollen grains, pollen-pistils compatibility, fertility and  
flow cytometry of single seeds. Herbarium specimens and our collection sites delimited  
the geographical distribution.  
Results: Meiotic embryo sacs of Polygonum type were observed in all analyzed ovules.  
No evidence of apomixis was detected. The mean pollen viability and in vivo pollen  
germination was 95.2% and 41.8%, respectively. The pollen tube growth in the  
selfed stigmas was 59.2 ± 6.39 µm / 3h. Seed set in self-pollination was 93.6 % and  
decreased to 52.7 % when there was heterospecific pollen available. Seeds analyzed  
by flow cytometric seed screen showed an embryo: endosperm ratio 2:3 indicated  
a sexual origin. Paspalum lilloi is a reophile and rupicolous species, specialized in  
fast-moving waters of waterfalls and it is a critically endangered endemism of Iguazu  
Waterfalls, in South America.  
1
. Instituto de Botánica del  
Nordeste, CONICET-UNNE, Facultad  
de Ciencias Agrarias, Universidad  
Nacional del Nordeste. Sargento  
Cabral 2131, 3400, Corrientes,  
Argentina.  
2
. Universidad de Buenos Aires,  
Facultad de Agronomía, Cátedra de  
Botánica Sistemática, Avenida San  
Martín 4453, C1417DSE Buenos  
Aires, Argentina.  
3
. Programa de Estudios Florísticos  
y Genética Vegetal, Instituto de  
Biología Subtropical CONICET-  
UNaM, nodo Posadas, Universidad  
Nacional de Misiones, Rivadavia  
2
370, 3300 Posadas, Argentina.  
Conclusions: P. lilloi is sexual, self-compatible and self-fertile species. Has a highly  
specialized habitat, which conservation will be a key step to avoid its extinction.  
*ahonfi@gmail.com  
Citar este artículo  
Key wordS  
REUTEMANN, A. V., E. J. MARTINEZ,  
G. H. RUA, M. SCHEDLER, J. R.  
DAVIÑA Y A. I. HONFI. 2021. El  
sistema genético de Paspalum lilloi  
Autogamy, endemism, fertility, heterospecific pollination, Paspalum lilloi, pollen-pistil  
compatibility.  
reSumen  
(
Poaceae), especie endémica de  
las Cataratas del Iguazú. Bol. Soc.  
Argent. Bot. 56: 253-268.  
Introducción y objetivos: Paspalum lilloi (Poaceae) es una especie diploide y endémica  
de las Cataratas del Iguazú y áreas circundantes, cuya biología reproductiva y área  
de distribución geográfica actual es desconocida. Los objetivos de este trabajo son  
conocer su sistema genético y delimitar la distribución y estado de conservación del  
endemismo.  
M&M:Elsistemagenéticosedeterminómediantecitoembriologíadesacosembrionarios,  
viabilidad y germinación in vivo de granos de polen, compatibilidad polen-pistilo,  
fertilidad y análisis de semillas por citometría de flujo. El área de distribución geográfica  
se delimitó mediante especímenes de herbario y colecciones propias.  
DOI: https://doi.  
org/10.31055/1851.2372.v56.  
n3.33273  
Resultados: Se observaron sacos embrionarios meióticos de tipo Polygonum en  
todos los óvulos analizados. La viabilidad media y germinación in vivo del polen  
fue de 95,22% y 41,79%, respectivamente. La tasa de crecimiento medio del tubo  
polínico en el estigma propio fue de 59,2 ± 6,39 µm / 3h. La producción de semillas en  
autopolinización fue del 93,61% y disminuyó al 52,72% cuando hay oferta de polen  
heteroespecífico. Los cariopsis analizados por citometría de flujo mostraron una  
relación de ploidía embrión: endospermo 2: 3, indicando un origen sexual. Paspalum  
lilloi es una especie reófila, rupícola y adaptada a saltos y cascadas, cuyo endemismo  
está en peligro crítico y circunscripto a las Cataratas del Iguazú.  
Conclusiones: P. lilloi es una especie sexual, autocompatible y autofértil, adaptada a  
hábitats altamente especializados, cuya conservación resultará clave para evitar su  
extinción.  
Recibido: 4 Jun 2021  
Aceptado: 23 Ago 2021  
Publicado en línea: 8 Set 2021  
Publicado impreso: 30 Set 2021  
Editor: Gabriel Bernardello  
PalabraS clave  
Autogamia, compatibilidad polen-pistilo, endemismo, fertilidad, Paspalum lilloi,  
ISSN versión impresa 0373-580X  
ISSN versión on-line 1851-2372  
polinización heteroespecífica.  
253  
Bol. Soc. Argent. Bot. 56 (3) 2021  
introducción  
poliploidía y la apomixis pseudogámica (ver también  
Quarin, 1999), y raramente con diploidía y sexualidad.  
La diversidad taxonómica de Paspalum enAmérica  
Las especies de Paspalum L. se distribuyen  
desde Norteamérica hasta los 40º de latitud S en es compleja y las aproximadamente 312-330 especies  
Argentina y Chile (Chase, 1929; Nicora & Rúgolo de descriptas se encuentran agrupadas en 4 subgéneros,  
Agrasar, 1987; Zuloaga & Morrone, 2005; Zuloaga Ceresia (Pers.) Rchb., Paspalum, Anachyris (Nees)  
et al., 2014). El centro de diversidad se halla en la Chase y Harpostachys (Trin.) S. Denham (Chase,  
región tropical de América, siendo particularmente 1929; Denham, 2005; Zuloaga & Morrone, 2005;  
abundante en Brasil (Chase, 1929; Valls, 1987). En Morrone et al., 2012; Scataglini et al., 2014), que  
Argentina, la Mesopotamia es la región con mayor incluyen una gran variabilidad morfológica, citológica  
diversidad de especies (Morrone & Zuloaga, 2012).  
y reproductiva. La mayor parte de sus especies han  
Paspalumsecaracterizaporlapresenciamayoritaria sido reunidas en grupos informales en base a sus  
de especies con número básico de cromosomas x= 10 afinidades morfológicas y ecológicas, como el ciclo  
y la existencia de distintos niveles de ploidía, que de vida y caracteres de las inflorescencias y espiguillas  
van desde diploides (2x) hasta hexadecaploides (16x) (Chase, 1929) que han sido mantenidos hasta el  
(
Honfi et al., 1990; Hojsgaard et al., 2009; Honfi et al., presente (Zuloaga & Morrone, 2005) ante la falta  
021). Se estima que el 80% de las especies estudiadas de una filogenia suficientemente resuelta y estable  
son poliploides y que la mitad de éstas son tetraploides que refleje grupos monofiléticos. El grupo informal  
Quarin, 1992; Ortiz et al., 2013). Todos los diploides Bertoniana reúne plantas perennes, cespitosas, con  
2
(
tienen comportamiento cromosómico regular en la inflorescencias compuestas por 2 a 11 racimos, con  
meiosis, con apareamiento cromosómico bivalente y espiguillas elipsoides y pilosas, con gluma superior  
segregación normal (Quarin, 1992; Ortiz et al., 2013; y lemma inferior superando el largo del antecio  
Honfi et al., 2021).  
superior, palea superior libre en el ápice, láminas  
Los diploides del género son reproductiva con costillas marcadas en la cara adaxial y cariopsis  
y funcionalmente sexuales, y la mayoría de los con hilo linear (Parodi & Nicora, 1966 inéd.; Türpe,  
poliploides exhiben apomixis de tipo apospórica 1967; Aliscioni, 2000; Zuloaga & Morrone, 2005). El  
(
Ortiz et al., 2013). La apomixis es una forma grupo comprende sólo dos especies filogenéticamente  
de reproducción asexual donde los gametos son relacionadas, que crecen en ambientes húmedos,  
producidos sin meiosis y se desarrolla un embrión junto a cascadas de agua, Paspalum lilloi Hack. y P.  
clonal, por lo tanto, genéticamente idénticos a la planta bertonii Hack. (Zuloaga et al., 2003; Hojsgaard et al.,  
madre (Nogler, 1984; Hojsgaard & Shartl, 2021). La 2009; Rua et al., 2010). La monofilia del grupo tiene  
mayoría de los diploides de Paspalum presentan un alto soporte tanto por los datos morfológicos como  
sistema de apareamiento por autoesterilidad (75%) y, moleculares (Aliscioni, 2002; Rua et al., 2010).  
por lo tanto, se comportan como alógamos, mientras  
que el 25% restante son autofértiles y autógamos encontrarse en paredones o pendientes rocosas,  
Quarin, 1992; Ortiz et al., 2013). Los estudios sobre cascadas y saltos, o bordes de ríos del noreste  
Paspalum lilloi es una especie que suele  
(
de compatibilidad polen-pistilo en Paspalum son de Argentina, sureste de Paraguay y suroeste del  
fragmentarios (Burson, 1986) y se han realizado en Brasil, principalmente en la zona de las Cataratas  
algunas especies diploides o poliploides tales como, del Iguazú (Zuloaga & Morrone, 2005; Hojsgaard  
P. bertonii Hack., P. dedeccae Quarin, P. denticulatum et al., 2009). Actualmente, estos ambientes se van  
Trin., P. distichumL., P. inaequivalveRaddi, P. palustre transformando por actividades antrópicas, como  
Mez, P. ramboi Barreto (Quarin & Burson, 1991), P. la construcción de represas hidroeléctricas sobre  
fasciculatum Willdenow ex Fluggé (Urbani, 1996), el Rio Paraná, y la perdida de hábitat debido a  
P. hydrophilum Henrard, P. palustre Mez (Martínez las fluctuaciones en el régimen hídrico afectan  
&
Quarin, 1999), P. chaseanum Parodi, P. plicatulum la supervivencia de estas especies higrófilas. Los  
Michx., P. simplex Morong. (Espinoza & Quarin, antecedentes cromosómicos indican que se trata de  
997), P. lenticulare Kunth, P. limbatum Henrard y una especie diploide con 2n = 2x = 20 cromosomas,  
1
P. guenoarum Arechav. (Espinoza et al., 2001), entre que se comportan regularmente en la meiosis y que  
otras. Estos trabajos indican que la autofertilidad posee un cariotipo unimodal con 20 cromosomas  
en Paspalum está generalmente relacionada con la metacéntricos (Hojsgaard et al., 2009; Reutemann et  
254  
A. V. Reutemann et al. - Sistema genético de Paspalum lilloi  
al., 2017). La información disponible sobre el modo de herbario están depositados en el Herbario del  
de reproducción, el síndrome de polinización, la Instituto de Botánica del Nordeste (CTES) y en el  
producción de semillas, el mantenimiento en cultivo Herbario ‘Gaspar Xuárez’ (BAA) de la Facultad  
y su estado de conservación en la naturaleza es de Agronomía, Universidad de Buenos Aires. Las  
inexistente, y por tal razón los objetivos de este trabajo plantas vivas se mantuvieron en cultivo en el Jardín  
son conocer el sistema genético mediante análisis del Botánico ‘Lucien Hauman’ de la FAUBA (Buenos  
modo reproductivo, compatibilidad polen-pistilo y Aires), y en los bancos de germoplasma de IBONE  
fertilidad, y delimitar el área y estado de conservación (Corrientes) e IBS (Posadas), Argentina.  
del endemismo de P. lilloi.  
Material estudiado: (con * se señalan los materiales  
mantenidos bajo cultivo).  
material y métodoS  
Material: ARGENTINA. Prov. Misiones.  
Material vegetal  
Dto. Iguazú, Parque Nacional Iguazú, Cataratas  
Los ejemplares de P. lilloi fueron coleccionados del Iguazú, 12/1/1994, Rúa et al. 127 (BAA)*.  
en las Cataratas del Iguazú, dentro del sector Dto. Iguazú, Salto Iguazú (Bañadas), 7/10/1910,  
ubicado en el Parque Nacional Iguazú, provincia de Stuckert 22453 (W, G, LIL); 7/10/1910, Lillo  
Misiones, Argentina (Fig. 1A- B). Los ejemplares 10526 (W, G, LIL, US, F); 1/8/1964, Burkart 25588  
Fig. 1. Modo de vida natural de P. lilloi. A. Hábitat especializado del endemismo. Nótese el borde de  
la cascada de agua, torrentoso. B. Sitio de colección de Martínez et al. 3 en el circuito superior de las  
Cataratas del Iguazú, Misiones, Argentina. Nótese el aspecto general de las plantas y la distribución de  
individuos de la población. C. Pastizal higrófilo monoespecífico de P. lilloi. D-E. Condiciones ecológicas en  
Cataratas del Iguazú. Parque Nacional Iguazú, Misiones, Argentina.  
255  
Bol. Soc. Argent. Bot. 56 (3) 2021  
(
SI); Rodríguez s.n, (BAA). Dto. Iguazú, Cataratas et al. 3 #1, #2, #3) y florecieron solamente en  
del Iguazú, Puerto Aguirre, 24/1/1922, Parodi 4376 2014 en Posadas, Misiones. Por otro lado, en los  
BAA, US). Dto. Iguazú, Parque Nacional Iguazú, años 2016, 2017 y 2019 florecieron las plantas  
Cataratas del Iguazú, 15/10/1993, Cabrera et al. cultivadas bajo cortina de agua semipermanente  
(
1
1
75 (SI). Cataratas del Iguazú, 18/1/1918, Hauman en Corrientes. Posteriormente, las plantas de  
1387 (SI); 28/8/1945, Krapovickas 2451 (SI). Corrientes se trasladaron dentro del invernáculo en  
Cataratas del Iguazú, Salto Mbigua, 17/12/2013, marzo del año 2020, y no volvieron a florecer aun  
Martínez et al. 3 (CTES)*. Cataratas del Iguazú, con nuevos repiques, fertilización y riego diario.  
Garganta del Diablo, 28/3/2004, Hojsgaard 335 El ejemplar Rua 127 (BAA 22741) se mantiene  
(
MNES). Cataratas del Iguazú, Isla San Martín, en cultivo en maceta desde 1994 en Buenos Aires,  
frente al Salto San Martín, 12/12/1983, Hunziker donde nunca floreció. Las matas de P. lilloi en  
1
4
0939 (SI); 15/10/1993, Tressens 4567 (CTES); cultivo se caracterizan por crecimiento cespitoso y  
/12/1993, Vanni 3219 (CTES). Cataratas del las hojas son discoloras, con el haz verde brillante y  
Iguazú, Isla San Martín, 4/3/1995, Zuloaga 5230 el envés estriado y glauco (Fig. 2A). Los ejemplares  
SI), 4/3/1995, Zuloaga 5339 (SI), 4/3/1995, de P. lilloi Martínez et al. 3 y Rua 127 presentan  
Zuloaga 5239 (MO, NY). Cataratas del Iguazú, diferencias principalmente en el ancho y largo de  
0/12/1991, Vanni 3025 (CTES); 4/12/1993, las hojas, siendo mayores en la accesión Martínez  
Vanni 3224 (CTES); 4/12/1993, Vanni 3619 et al. 3 (Fig. 2B). Las plantas se adaptaron a las  
CTES). Cataratas del Iguazú, Meseta De Los Tres condiciones de cultivo en todos los casos, pero  
(
2
(
Mosqueteros, 10/12/1995, Vanni 3912 (CTES). la floración en cultivo solo ocurrió en las plantas  
Cataratas del Iguazú, camino a Puerto Canoas, ubicadas en el circuito hídrico del IBONE bajo una  
3
/3/1995, Zuloaga 5226 (SI, MO). Misiones, corriente de agua continua y llovizna permanente.  
Posadas, 1/12/1900, Gallardo 11386 (SI). BRASIL.  
Estado Paraná, Salto Iguaçu, Rambo 53619 (US). Análisis de óvulos maduros por citoembriología  
Mun. Foz do Iguaçu, Parque Nacional do Iguaçu,  
4/1/1967, Hatschbach 23168 (K, NY); 8/10/1946, de la antesis fueron analizados mediante  
Kuhlmann 57729 (IAN, US), 8/3/2018, Valls 23168 citoembriología clásica en la accesión Martínez  
NY). PARAGUAY. Dto. Alto Paraná. “Yguy”. et al. 3. Para ello, se fijaron inflorescencias al  
Los sacos embrionarios maduros al momento  
2
(
Chodat, R. s.n. (G).  
momento de la antesis en FAA (etanol 70%:  
formaldehído: ácido acético 18:1:1) al menos  
durante 24 h. Luego, fueron conservadas en etanol  
Cultivo ex situ  
A los fines de conocer cuáles serían las 70% a 4 °C hasta su análisis. Se diseccionaron 30  
condiciones apropiadas para cultivar esta especie, se pistilos y se conservaron en etanol 70% en heladera.  
recrearon parcialmente las condiciones especiales Los pistilos fueron deshidratados en una serie de  
de crecimiento reófilo de P. lilloi. Los macollos combinaciones de alcohol etanol y alcohol ter-  
fueron trasplantados a una maceta grande con butílico en concentración creciente, e incluidos en  
sustrato profesional enriquecido con nutrientes, y parafina para obtener cortes longitudinales de 12  
se colocaron en un circuito hídrico semipermanente µm de espesor en micrótomo rotatorio. Los cortes  
que simula una cortina (vertical) de agua construida obtenidos fueron coloreados con técnica clásica de  
sobre la pared externa del invernáculo del IBONE safranina y fast green, y se montaron en bálsamo  
en Corrientes (Argentina). La columna de agua cae de Canadá.  
dentro de una canaleta que simula una corriente  
Por otra parte, esta metodología se combinó con  
horizontalenlazonadondesecolocaronlasmacetas. el análisis mediante la técnica de diafanizado de  
Simultáneamente, otras macetas se mantuvieron en pistilos con metilsalicilato propuesta por Young  
cultivo también en maceta grande, sin cortina de et al. (1979) con las modificaciones introducidas  
agua, pero con plato recipiente de agua permanente por Zilli et al. (2015). Los pistilos diseccionados  
y riego periódico diario, en Posadas, Misiones. y conservados en etanol 70%, se colocaron en  
Ambos tratamientos a la intemperie y sujetos a peróxido de hidrogeno al 3% por 2 h. Luego, fueron  
las condiciones climáticas imperantes. Las plantas sometidos a deshidratación en una serie de etanol  
fueron obtenidas en diciembre de 2013 (Martínez creciente (50%, 70%, 95%, 100%) por 30 min cada  
256  
A. V. Reutemann et al. - Sistema genético de Paspalum lilloi  
Fig. 2. Paspalum lilloi. A. Planta en antesis (Martínez et al. 3). Nótese las hojas discoloras. B. Detalle  
comparativo del ancho de las hojas entre accesiones: izq. Martínez et al. 3; der. Rua et al. 127, ambas  
provenientes de las Cataratas del Iguazú, Misiones, Argentina. C. Detalle de la inflorescencia con los  
racimos basales y medios en antesis y los superiores en pre-antesis. D. Polen coloreado con Lugol (viable)  
y no coloreado (inviable). Escala= D: 25 µm.  
paso, y a clarificación en una serie de metilsalicilato: Seed Screen) se determinó simultáneamente el  
etanol (50%, 75%, 85%) por 30 min cada paso, contenido relativo de ADN (2C) en tejidos del  
hasta la utilización de metilsalicilato puro para el embrión y endospermo. Para ello, se empleó el  
diafanizado (por 12 h). Los pistilos diafanizados citometro CyFlow® Space de Sysmex- Partec, que  
fueron colocados en un portaobjetos con una cuenta con una lámpara UV-LED (3 w a 365 nm)  
gota de metilsalicilato y luego los óvulos fueron y los filtros estándares para DAPI. Las mediciones  
observados bajo un microscopio con dispositivo de del contenido relativo de ADN fueron realizadas de  
contraste de interferencia diferencial (DIC).  
acuerdo con las instrucciones descritas en Galdeano  
et al. (2016). El análisis de los datos fue hecho  
con el software FloMax de Partec. Se consideró  
Análisis de semillas por citometría de flujo  
A partir del análisis individual de semillas que las semillas de origen sexual tienen embriones  
mediantecitometríadeflujo(FCSS,FlowCytometric constituidospor[(n+n)=2n=2x= 2C] y endospermo  
257  
Bol. Soc. Argent. Bot. 56 (3) 2021  
[(n + n) + n= 2n= 3x= 3C], provenientes de la doble- Las inflorescencias fueron ensobradas la noche  
fecundación de la oósfera y los núcleos polares de previa a la antesis para evitar la llegada de polen  
la célula central respectivamente, por los núcleos foráneo y garantizar el suministro de polen propio  
cromosómicamente reducidos (n) aportados por a los estigmas. Una vez iniciada la antesis, las  
el polen. Si se trata de una planta diploide, en sus inflorescencias se fijaron en etanol absoluto: ácido  
semillas de origen sexual el embrión también será acético glacial (3: 1) durante 24 h y se diseccionaron  
diploide y el endospermo triploide. Se utilizaron diez pistilos por planta, a partir de espiguillas en  
hojas de frescas de Martínez et al. 3 como control antesis. También se fijaron espiguillas en post-  
externo, para asegurar que el valor 2C en los antesis a 3-4 h de iniciada la misma, considerando  
histogramas refiere a la condición diploide y que la antesis no se inicia simultáneamente en todas  
semillas (N=17) de la misma accesión.  
las espiguillas de una inflorescencia. Para ello, se  
condujeron las macetas con las plantas en antesis  
al laboratorio y se observó su desarrollo (Fig.  
Determinación de la viabilidad de polen  
La disponibilidad de polen viable al momento 2A). Las inflorescencias fijadas fueron enjuagadas  
de la antesis se analizó con el método de coloración una vez con etanol 70% para eliminar el polen no  
con Lugol (Iodo-Ioduro de potasio 1%), a partir de adherido a la misma. Los pistilos se colocaron  
polen fresco. Se determinó el porcentaje de granos en hidróxido de sodio (NaOH) 5N durante 72 h  
de polen teñidos sobre un mínimo de 1000 granos en vidrio reloj a temperatura ambiente, luego se  
analizados en 3 repeticiones de polen fresco y lavaron con etanol absoluto y se dejaron durante  
una de polen fijado en mezcla de Clarke (1851), 24 h en solución de azul de anilina 0,1%. Luego,  
etanol absoluto: ácido acético glacial (v/v; 3:1) se observaron las estructuras en microscopio de  
durante 12 - 24 h, y luego coloreado con solución epifluorescencia utilizando portaobjetos cóncavos  
de Müntzing (glicerol y solución de carmín acético con una gota de solución de azul de anilina 0,1%.  
al 1%, v/v, 1:1) por 24 h.  
Se analizó un número mínimo de 30 granos de  
polen por pistilo. Se consideraron germinados  
aquellos granos de polen cuyo tubo polínico tenía  
Medición del tamaño de granos de polen  
A partir de la muestra de polen fresco teñido una longitud igual o mayor al diámetro promedio  
con Lugol 1%, se tomaron mediciones del calculado previamente para los granos de polen.  
diámetro sobre el eje polar de 60 granos de polen, Se tomaron microfotografías usando el software  
considerando que en vista polar son circulares y Leica LAS V4.0 y para las mediciones se utilizó el  
en vista ecuatorial levemente elípticos. El valor software ImageJ (Maryland, USA).  
del diámetro promedio se usó como referencia  
para la evaluación de la germinación in vivo del Estimación de la producción de semillas  
polen al momento de la antesis, y se consideró  
La producción de semillas se estableció  
como germinado al grano de polen cuyo tubo mediante el porcentaje de espiguillas que  
polínico presentó una longitud igual o mayor a desarrollaron grano (cariopsis). Esta determinación  
dicho diámetro (Dawkins & Owens, 1993). Para se realizó en condiciones de autopolinización en la  
las mediciones se utilizó el software ImageJ accesión Martínez et al. 3. Para ello, se ensobraron  
(
Maryland, USA).  
inflorescencias en bolsas de papel sulfito antes de  
que se inicie la antesis y de esta manera se evitó  
Análisis de la compatibilidad polen-pistilo y la fecundación con polen de otras plantas. Las  
germinación in vivo del polen espiguillas autopolinizadas (N=94) se cosecharon  
La determinación de la compatibilidad polen– al cabo de 25 días y luego se procedió a la  
pistilo, se realizó con la técnica de diafanización separación y conteo de las que formaron cariopsis  
y coloración con azul de anilina de acuerdo con y las vanas.  
Kho & Bäer (1968) en la accesión Martínez et  
al. 3. Se determinó la germinación de los granos Ensayos de autofecundación con polen  
de polen y el crecimiento del tubo polínico heteroespecífico  
utilizando espiguillas fijadas bajo condiciones los ensayos de  
Simultáneamente  
a
de autopolinización de individuos en cultivo. autopolinización, se realizaron cruzamientos  
258  
A. V. Reutemann et al. - Sistema genético de Paspalum lilloi  
utilizando polen de P. bertonii (accesión Honfi reSultadoS  
147, Salto Tabay, Misiones, Argentina, MNES)  
sobre estigmas de P. lilloi, para observar la Modo de reproducción  
2
incidencia de polen foráneo heteroespecífico en la  
A partir del análisis citoembriológico de  
tasa de producción de cariopsis en comparación a espiguillas en antesis, se observó en cada óvulo  
la producción bajo autopolinización controlada de la presencia de un único saco embrionario de  
P. lilloi. Para ello, se ensobraron las inflorescencias origen meiótico (SEM), de forma elongada,  
de ambas especies el día previo a la antesis y se ubicado sobre el eje micrópilo-chalazal. El  
mantuvieron de ese modo durante 25 días hasta la 95,45 % de los óvulos presentaron un SEM  
cosecha. Las espiguillas de cada especie fueron completamente desarrollado. El 5,55% de los  
discriminadas bajo una lupa y se separaron óvulos restantes presentaron sacos embrionarios  
las fructificadas de las vanas. Se efectuaron abortados. En Paspalum lilloi, el SEM está  
4
repeticiones del ensayo con las mismas constituido por un aparato oosférico formado  
plantas maternas y paternas en condiciones de por la oosfera y dos sinérgidas, una célula central  
invernáculo. La elección de P. bertonii se basó con dos núcleos polares cuyos nucléolos son  
en la estrecha relación filogenética entre ambas de tamaño prominente, y 3-7 antípodas. No se  
especies y en la distribución simpátrica de las observó una mayor proliferación de antípodas  
mismas.  
en el polo chalazal del saco embrionario. Esta  
constitución del saco embrionario indica que es  
Delimitación del área actual de ocurrencia del de tipo Polygonum (Fig. 3A-B).  
endemismo y estado de conservación  
Se analizaron un total de 17 semillas por  
En base a la revisión exhaustiva de especímenes citometría de flujo, y todas presentaron una  
de herbarios, bases de datos disponibles y viajes proporción relativa de ADN del embrión:  
de colección botánica realizados en el área endospermo de 2:3, indicando que se originaron  
durante varios años, se confeccionó una lista de por una vía sexual (Fig. 4).  
especímenes de herbario, cuyas procedencias  
delimitan el área de ocurrencia actual del Viabilidad y tamaño del polen  
endemismo. En base a estos puntos de ocurrencia,  
La antesis en P. lilloi es matutina y ocurre a  
y eliminando los registros duplicados, se elaboró partir de la media mañana (9:00h am). La antesis  
un mapa de distribución geográfica actualizado ocurre asincrónicamente en las espiguillas de  
para la especie utilizando el software DivaGIS una inflorescencia, iniciando en los racimos  
(
Hijmans et al., 2004). Se calculó el área del inferiores y prosiguiendo hacia los superiores  
polígono convexo que encierra a los puntos, (Fig. 2C). La viabilidad del polen promedio fue  
utilizando el paquete dismo del software R (R de 94,3% y se estimó a partir de 3620 granos de  
Core Team, 2020; Hijmans & Elith, 2017).  
polen provenientes de 4 inflorescencias (Fig. 2D,  
El estado de conservación de la especie fue Tabla 1). La viabilidad de polen fresco mostro  
determinado de acuerdo a los criterios establecidos un rango de variación entre 80,3-98,8% y la  
por UICN v.14 (2019). Los criterios considerados viabilidad de polen fijado fue de 92,0% (Tabla  
por UICN son: A, Reducción del tamaño 1).  
poblacional; B, Tamaño del área de distribución  
El diámetro promedio de los granos de polen  
geográfica; C, Tamaño poblacional pequeño; coloreados fue de 36,24µm ± 0,52 y se estimó  
D, Población muy pequeña o distribución muy sobre un total de 60 granos medidos. Los granos  
restringida; E, Análisis cuantitativo del riesgo de polen no coloreados fueron más pequeños que  
de extinción. Las categorías definidas por UICN los coloreados y sobre un total de 30 granos, el  
son nueve, sin embargo, se consideraron en la tamaño medio fue de 28,0µm ± 0,42.  
evaluación las categorías amenazadas En Peligro  
Crítico (CR), En Peligro (EN) y Vulnerable (VU). Sistema de apareamiento y polinización  
Para la asignación de la categoría correspondiente,  
se consideró todo el rango de distribución de P. lilloi, la polinización comienza con la  
geográfica de P. lilloi. adhesión de los granos de polen a la papila  
A partir de la llegada del polen al estigma  
259  
Bol. Soc. Argent. Bot. 56 (3) 2021  
polen fresco y fijado (Tabla 1), se observó que  
la proporción de granos germinados en el pistilo  
fue menor a la esperada (Tabla 2). Los tubos  
originados de granos ubicados en la porción  
superior del estigma crecieron una corta distancia  
a lo largo de las ramas y pocos llegaron al eje  
central colector del estigma al cabo de 3-4 h.  
Los tubos polínicos en las porciones medias e  
inferiores del estigma también presentaron una  
elongación corta y sólo algunos alcanzaron el  
eje central. La tasa de crecimiento medio del  
tubo polínico in vivo fue de 59,2 ± 6,39 µm/  
3
h. La máxima extensión de crecimiento del  
tubo polínico fue de 118,75µm/ 3h, mientras  
que la mínima fue de 31,25µm/ 3h, para el  
lapso post-antesis. Solo 1-3 tubos polínicos  
alcanzan el micrópilo del óvulo a las 3-4 h de  
iniciada la antesis. Los resultados indican que la  
fecundación se realiza a posteriori de al menos 4  
h transcurridas del inicio del crecimiento del tubo  
polínico.  
Producción de semillas  
En condiciones de autopolinización, se  
obtuvieron 88 espiguillas con cariopsis  
completamente desarrollados, sobre un total de  
Fig. 3. A-B. Cortes consecutivos de un saco  
embrionario meiótico (SEM) maduro de Paspalum  
lilloi. A. Primer corte. Se observa el SEM ubicado  
sobre el eje micrópilo-chalazal. En el polo micropilar,  
9
4 espiguillas analizadas de una sola planta, por  
se observa la oosfera (oo) con núcleo y nucléolo lo que la producción de semillas fue del 93,6%  
coloreados, y citoplasma de las sinérgidas (s). En (accesión Martínez et al. 3).  
la porción media, la célula central (cc) con muchas  
vacuolas y en el extremo chalazal las antípodas  
Los cuatro ensayos de polinización  
heteroespecífica produjeron una menor  
(
a), con nucléolos de coloración rojo tenue. B.  
Segundo corte. En la célula central se observan  
núcleos polares (np) con nucléolos prominentes  
cantidad de semillas que las producidas por  
autopolinización. El promedio de producción de  
semillas fue de 52,7% (Tabla 2). Los cariopsis  
obtenidos son considerados producto de la  
autopolinización de P. lilloi, aunque no podemos  
2
y hacia la chalaza, más antípodas. C-D. Óvulo  
clarificado con un SEM. C. Primera imagen, aparato  
oosférico, célula central con grandes vacuolas y  
nucléolo de un núcleo polar, más varias antípodas. descartar el origen hibrido de algunos de ellos.  
D. Segunda imagen, se observa segundo núcleo  
polar y antípodas. Abreviaturas = a: antípodas; cc:  
célula central; np: núcleos polares; oo: oosfera; s:  
sinérgida. Escalas= A-D: 26,1 µm.  
Área del endemismo y estado de conservación  
En base al material de herbario estudiado y  
viajes de exploración botánica al área potencial de  
ocurrencia de P. lilloi, se obtuvieron seis puntos  
de presencia, de los cuales cinco provienen de  
estigmática (Fig. 5A-C, Fig. 6A) y prosigue con los saltos, cascadas y rápidos de las Cataratas del  
la hidratación y germinación del grano de polen Iguazú (Argentina - Brasil) (Fig. 7). El especímen  
(
Fig. 5D-F) hasta alcanzar el micrópilo (Fig. 5A- restante (Chodat s.n.; G) no fue incluido en  
D). el cálculo del área ocupada por la especie por  
La germinación de los granos de polen in vivo tratarse de una geolocalización dudosa. Con los  
fue del 41,79% a 3-4 h posteriores a la antesis. puntos de ocurrencia en Cataratas del Iguazú, se  
2
Tomando en cuenta los valores de viabilidad del calculó un área poligonal convexa de 45,4 km  
260  
A. V. Reutemann et al. - Sistema genético de Paspalum lilloi  
Fig. 4. Histograma representativo del análisis por citometría de flujo de semillas de P. lilloi. El histograma  
corresponde a una semilla de origen sexual, donde se observan los picos del embrión (2C) y endosperma  
(3C), ambos correspondientes a la fase G0/G1 del ciclo celular, y el pico correspondiente a la fase G2 del  
ciclo celular del embrión (4C).  
(
= 4543 ha). La ausencia de un mayor número amenazadas, P. lilloi pertenece a la categoría En  
de puntos de localización imposibilita realizar Peligro Crítico, según los criterios B1ab (i, ii)  
proyecciones fidedignas del área potencial o de + 2ab(i, ii). Esta clasificación significa que la  
futura ocurrencia.  
especie posee una extensión de presencia inferior  
Tomando como referencia los criterios a 100 km² (B1), que actualmente se conoce una  
descritos por la UICN v.14 para determinar si única localidad geográfica y ecológica (a), ya  
un taxón se encuentra dentro de las categorías que se encuentra restringida al área binacional  
de Cataratas del Iguazú (Argentina – Brasil) y  
que existe una disminución (b) en la extensión  
de presencia (i) y por ende del área de ocupación  
Tabla 1. Viabilidad del polen de P. lilloi.  
(ii) de la especie en al menos los últimos 10 años.  
El área de extensión de presencia (EOO) es el  
área contenida dentro de los límites calculados en  
el polígono convexo incluyendo todos los sitios  
conocidos donde se encuentra presente P. lilloi (Fig.  
Nº Granos  
de polen  
llenos  
Nº Total  
de granos % Viables  
de polen  
Material  
Polen fresco  
Polen fresco  
Polen fresco  
Polen fijado  
Total  
1062  
1112  
321  
1095  
1125  
400  
97,0  
98,8  
80,3  
92,0  
94,3  
7
). El área de ocupación (AOO) representa el área  
de hábitat adecuado actualmente ocupado por P.  
lilloi dentro del polígono convexo calculado, que en  
2
nuestra especie está estimado en 8 km (800 ha, B2),  
920  
1000  
3620  
basándonos en los cálculos sugeridos por la IUCN  
v.14 para la estimación del AOO (Fig. 7).  
3415  
261  
Bol. Soc. Argent. Bot. 56 (3) 2021  
Fig. 5. Germinación in vivo del polen de P. lilloi. A: Granos de polen adheridos a las papilas estigmáticas. B  
y C. Grano de polen germinado. Nótese longitud del tubo polínico. D-F. Granos de polen germinados, con  
tubo polínico creciendo a través de las papilas estigmáticas. Escalas= A-F: 25 µm.  
Tabla 2. Ensayos de polinización homoespecífica y heteroespecífica y producción de semillas de P. lilloi  
(Martínez et al. 3).  
Proceso de autopolinización  
Polinización heteroespecifica  
Nº de  
espiguillas  
de P.  
lilloi con  
cariopsis  
Nº de  
N° de  
N° de  
Tubos  
polínicos  
en el  
Ensayo  
Granos  
de polen  
adheridos  
al estigma  
espiguillas  
P. lilloi ♀  
Total de  
granos  
de polen.  
N° de  
granos  
germinados  
Tubos  
% GP polínicos  
en el  
de P.  
(M3) X P.  
bertonii ♂  
(H2147)  
%
lilloi con  
cariopsis  
/ Total  
Estigma * Micrópilo **  
/
Total  
1
154 / 286 53,84  
1390  
809  
581  
41,79  
581  
ca. 3 (1-3)  
88 / 94  
2
3
56 / 80  
80 / 116  
87 / 233  
70,00  
68,97  
37,33  
4
Total  
x ± E.E  
377 / 715 52,73  
59.47 ± 8,8  
*
3 h post-antesis; GP: Germinación de granos de pollen; E.E.: error estándar  
* 4 h post antesis  
*
262  
A. V. Reutemann et al. - Sistema genético de Paspalum lilloi  
Fig. 6. Detalle del pistilo de P. lilloi. A. Estigma plumulado. B. Ramificaciones del estigma y algunos  
granos de polen adheridos al estigma. C. Papila estigmática. D. Óvulo maduro y ovario. E. Detalle del  
óvulo maduro, a 3 h posteriores a la antesis. Nótese el contorno de calosa que rodea al saco embrionario.  
Escalas= A-E: 25 µm.  
Fig. 7. Localización geográfica del área ocupada por el endemismo de P. lilloi. Nótese circunscripción  
restringida a las Cataratas del Iguazú (Argentina – Brasil).  
263  
Bol. Soc. Argent. Bot. 56 (3) 2021  
diScuSión  
superficie estigmática seca (Connor, 1979) de modo  
que los granos de polen deben hidratarse para iniciar  
Los sistemas genéticos en Paspalum tienen la adhesión al estigma. Esta interacción polen–  
una asociación estrecha con el nivel de ploidía. pistilo establece límites de autogamia (endogamia)  
Alrededor del 20% de las especies del género fueron o de alogamia (exogamia). Paspalum lilloi resultó  
caracterizadas según su sistema genético, y los completamente autofértil, con crecimiento del  
diploides son funcionalmente de reproducción sexual tubo polínico y alta producción de semillas en  
(Ortiz et al., 2013). Todos los citotipos diploides condiciones controladas de autopolinización.  
de Paspalum presentan un saco embrionario tipo La autopolinización y autofecundación son  
Polygonum y P. lilloi no es una excepción a la regla. claramente dos etapas distintas dentro del proceso  
Además, carece de potencial para apomixis, puesto de autogamia. La inducción de autofecundación en  
que no se observaron indicios de formación de sacos plantas autoincompatibles mediante polen foráneo  
embrionarios adicionales al meiótico como ocurre de un citotipo diferente e incluso de una especie  
en algunas especies (Ortiz et al., 2013).  
emparentada, también llamada efecto mentor,  
La compatibilidad polen-pistilo refleja el grado en ocasiones origina progenies viables (Quarin  
de éxito esperado en cruzamientos conespecificos & Norrmann, 1987; Burton & Hanna, 1992;  
en las plantas sexuales. La polinización exitosa en Hörandl, 2010; Delgado et al., 2014). Este efecto  
producir una semilla requiere que el polen transite ha sido reportado principalmente en cruzamientos  
a través de diversos tejidos florales para fecundar la heteroespecíficos, y no requiere de polen viable  
oósfera y la célula central (Swanson et al., 2004). ni funcional (Nettancourt, 2001; Hojsgaard &  
Los cariopsis de P. lilloi presentaron una proporción Hörandl, 2019), excepto que se pretenda hibridación  
2:3 de contenido relativo de ADN en los tejidos del inter- específica. Por otro lado, la polinización  
embrión y el endospermo, que indica que tienen heteroespecífica en plantas autocompatibles y  
un origen reproductivo sexual, en concordancia autógamas como P. lilloi puede afectar de diversa  
con la presencia exclusiva de sacos embrionarios manera la producción de semillas. En este caso, la  
meióticos.  
presencia de polen heteroespecífico en el estigma  
Tanto la autofertilidad como la autoesterilidad de P. lilloi tuvo consecuencias negativas en la  
han sido reportadas en los diploides de autofecundación, ya que la producción de semillas  
Paspalum, pero la mayoría son alógamos por fue menor en los experimentos de polinización  
autoincompatibilidad polen-pistilo (Ortiz et al., heteroespecífica en comparación con los casos  
2
013). La autopolinización, autocompatibilidad y en los que la polinización fue exclusivamente  
autofecundación como mecanismos de autogamia conespecifica. Este efecto probablemente se deba a  
son infrecuentes en los citotipos diploides de que existieron interferencias del polen extraño sobre  
Paspalum. Entre los pocos casos estudiados el potencial de autogamia esperado. En general, se  
experimentalmente se mencionó a P. juergensii espera que las fallas en la polinización resulten  
Hack. (Burson, 1991, 1992), P. pumilum Nees menos intensas en especies autocompatibles o  
(
1
Reutemann, 2020) y P. repens J. P. Berg. (Burson, autógamas (Larson & Barret, 2000). Asumiendo  
997), todas especies exclusivamente diploides que no existen factores extrínsecos a la polinización  
que están ampliamente distribuidas en América y que la provisión de polen compatible a los  
Zuloaga & Morrone, 2005; Reutemann, 2020). estigmas receptivos fue suficiente en calidad y  
(
Por primera vez se describe autocompatibilidad, cantidad, las fallas en la producción de semillas que  
autofertilidad y autofecundación en P. lilloi, que ocasionaron una disminución de la proporción de  
también es una especie exclusivamente diploide, espiguillas fructificadas, podrían relacionarse con  
pero cuya distribución geográfica es restringida por una inhibición física por obstrucción y/o química  
el hábitat específico en el cual crece.  
causada por la presencia simultánea de polen propio  
Durante la polinización, el grano de polen hace y foráneo, sin embargo, no encontramos evidencias  
contacto con las células receptivas del estigma, claras a favor de uno u otro factor. McLernon et  
que favorece al crecimiento del polen de algunos al. (1996) observaron que la disminución en la  
genotipos, mientras que se opone o rechaza otros producción de semillas en especies autógamas  
(Swanson et al., 2004). Las gramíneas poseen una en presencia de polen heteroespecífico podría  
264  
A. V. Reutemann et al. - Sistema genético de Paspalum lilloi  
explicarse como consecuencia de la interferencia  
El estado de conservación actual de P. lilloi  
física (por obstrucción) o química que afectan a es en peligro crítico (CR) dado que se encuentra  
2
la deposición, adherencia y germinación del polen circunscripto a un área menor de 100km y todos  
propio en los estigmas. Otra posible explicación los sitios de localización se encuentran limitados a  
del bajo número de semillas puede ser el aborto las áreas protegidas que rodean a las Cataratas del  
temprano de la semilla autofecundada debido Iguazú en Argentina y Brasil. La conservación del  
a la depresión por endogamia (Tas & Van Dijk, hábitat especializado de P. lilloi resulta clave para  
1
999); sin embargo, no hemos encontrado evitar su extinción y para ello es necesario aunar  
espiguillas con desarrollo parcial de cariopsis u esfuerzos entre los tres países (Argentina, Brasil y  
otros indicios en ninguno de los experimentos. Paraguay) para conservar esta especie amenazada  
Alternativamente, es posible que haya ocurrido luego del impacto antrópico ocurrido sobre sus  
cierta interacción inhibitoria de la fecundación por poblaciones naturales. Felizmente, las Cataratas  
competencia del polen propio y el heteroespecífico, del Iguazú están dentro de un área protegida y,  
puesto que cabría esperar que actúen barreras de dada su importancia como atracción turística  
preapareamiento entre P. bertonii y P. lilloi en internacional, parece poco probable que esa área  
los pistilos de esta última. Los mecanismos de sea alterada sustancialmente por otras actividades  
aislamiento reproductivo podrían estar actuando humanas. Sin embargo, las fluctuaciones del nivel  
entre ambas especies.  
del agua en el caudal del rio Iguazú, podrían  
comprometer la conservación a largo plazo. Resulta  
prioritario aumentar los esfuerzos para determinar  
Estado de conservación y área del endemismo  
Paspalum lilloi posee distribución geográfica el tamaño de las poblaciones existentes como el  
acotada, restringida a la zona correspondiente a las grado de variabilidad genética que presentan y  
Cataratas del Iguazú (Argentina - Brasil) sobre el simultáneamente conservar germoplasma para  
Rio homónimo. Esta especie es endémica y cuenta restauración. Los datos obtenidos permitirán  
con una baja capacidad de dispersión, debido concretar el registro de P. lilloi en la lista roja  
principalmente a su especialización ecológica de especies amenazadas de UICN y proponer la  
reófila, con condiciones ambientales altamente generación de instrumentos legales que garanticen  
específicas, de suelos rocosos húmedos a anegados, su protección.  
con aguas corrientes torrentosas permanentes y  
altos niveles de humedad relativa ambiente, incluso  
neblina permanente en algunos sitios. Paspalum concluSión  
lilloi habita cuerpos de agua, formando sectores de  
pastizales higrófilos más o menos monoespecíficos  
Paspalum lilloi es una especie diploide, sexual,  
en sectores del borde superior de las cascadas y autocompatible y autofértil, cuya distribución  
saltos de las Cataratas del Iguazú, incluso habita en geográfica se encuentra restringida a las Cataratas  
los paredones de la Garganta del Diablo, donde el del Iguazú y en peligro crítico de conservación.  
torrente de agua posee su mayor volumen y fuerza Las plantas en peligro crítico de extinción como  
de arrastre. Se trata de una especie reófila rupícola las endémicas adaptadas a hábitats altamente  
firmemente arraigada a las piedras y resistente a la especializados tienen alto riesgo de fallas en  
fuerza de arrastre de la corriente hídrica.  
la polinización cuando existen altos niveles de  
El área estimada de ocupación actual de este fragmentación de sus poblaciones, y la existencia  
endemismo apenas excede aguas arriba y aguas de autogamia asegura la fertilidad a pesar de la  
abajo de las Cataratas de Iguazú (Argentina - inherente depresión por consanguinidad esperada.  
Brasil). Resta explorar con mayor exhaustividad la  
presencia remanente de P. lilloi en sitios similares  
circundantes en Paraguay, tales como en la flora agradecimientoS  
higrófila asociada a los Saltos del Monday (sobre  
el Río Monday) y en los rápidos del Río Acaray,  
aunque no existen colecciones recientes de la facilidades otorgadas por la Administración de  
especie en dicho país (Zuloaga et al., 2014). Parques Nacionales, autoridades regionales y  
Los autores agradecemos el apoyo y las  
265  
Bol. Soc. Argent. Bot. 56 (3) 2021  
del P. N. Iguazú y a sus guardaparques por las BURSON, B. L. 1992. Cytogenetic relationships  
atenciones recibidas. AVR y AIH agradecen las  
facilidades otorgadas para consultar especímenes  
a los curadores de los siguientes herbarios: CTES,  
between Paspalum dilatatum y P. cromyorrhizon,  
P. indecorum y P. laxum. Int. J. Plant Sci. 153: 244-  
249. https://doi.org/10.1086/297028  
BAA, SI, CORD en Argentina y PY, FACEN, FCQ, BURSON, B. L. 1997. Apomixis and sexuality in some  
y SCP de Paraguay. Agradecemos la asistencia  
técnica de la Lic. F. Eckers en CF. Este trabajo fue  
Paspalum species. Crop Sci. 37: 1347-1351. https://doi.  
org/10.2135/cropsci1997.0011183X003700040052x  
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AIH, JRD y AVR diseñaron la investigación.  
GHR, EJM, MS y AIH realizaron las colectas.  
AVR obtención, análisis e interpretación de datos  
y redactó la primera versión del manuscrito. Todos  
los autores revisaron y acordaron la versión final.  
AIH editó la versión final.  
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