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Summary
Background and aims: The present investigation corresponds to a molecular
taxonomic analysis of oral samples of plants naturally established in a remote
area of the Atacama Desert, Arica-Parinacota Region, Chile. In the rst instance,
the samples were morphologically attributed to the genus Lathyrus, however,
according to current literature, no individuals of this genus have been registered
in the region, given this, confusion has been generated in the identication of the
collected samples. Therefore, the present research aims to genetically identify the
presumably Lathyrus species, using DNA Barcoding.
M&M: In the present study we evaluated these individuals by a phylogenetic analysis
to determine their taxonomic identity from ITS (nuclear) sequence and psbA, matK
and rpoC1 (plastidic) sequences.
Results: The results demonstrated that the individuals are related to the species
Lathyrus odoratus.
Conclusions: The four DNA barcoding loci allowed the samples to be genetically
identied as L. odoratus, which is found growing naturally in Chile.
Key wordS
DNA barcoding, ITS, Lathyrus odoratus, matK, psbA-trnH, rpoC1.
reSumen
Introducción y objetivos: La presente investigación corresponde a un análisis
taxonómico molecular de muestras orales obtenidas de plantas establecidas
naturalmente en una zona recóndita del Desierto de Atacama, Región de Arica-
Parinacota, Chile. En primera instancia, las muestras morfológicamente se
atribuyeron al género Lathyrus, sin embargo, conforme a la literatura actual,
no se han registrado individuos de este género en la región, dado esto, se ha
generado confusión en la identicación de las muestras colectadas. Por lo cual,
la presente investigación tiene por objetivo identicar genéticamente las especies
presuntamente de Lathyrus, mediante DNA Barcoding.
M&M: En el presente estudio se evaluaron estos individuos mediante un análisis
logenético para determinar su identidad taxonómica a partir de secuencias ITS
(nuclear) y secuencias psbA, matK y rpoC1 (plastídicas).
Resultados: Los resultados demostraron que los individuos están relacionados a la
especie Lathyrus odoratus.
Conclusiones: Los cuatro loci de DNA barcoding, permitieron identicar
genéticamente las muestras como L. odoratus, el cual se encuentra creciendo de
manera natural en Chile.
PalabraS clave
DNA barcoding, ITS, Lathyrus odoratus, matK, psbA-trnH, rpoC1.
IntroduccIón
El desierto de Atacama se encuentra en la región Norte Grande de
Chile y es considerado el desierto más antiguo y continuamente más
seco de la Tierra, siendo árido desde el período Jurásico e hiperárido
desde el Mioceno (Hartley et al., 2005). La mayoría de los grupos
1. Centro Regional de Investigación
y Desarrollo Sustentable de
Atacama (CRIDESAT), Universidad
de Atacama, Copayapu 485,
Copiapó, Chile.
2. Departamento de Educación,
Facultad de Humanidades y
Educación, Universidad de
Atacama, Copayapu 485, Copiapó,
Chile.
*roberto.contreras@uda.cl
Citar este artículo
ARIAS ABURTO, M., D. RAMÍREZ
MEDINA y R. CONTRERAS DÍAZ.
2020. Análisis taxonómico
molecular de individuos del género
Lathyrus hallados en el extremo
norte de Chile, mediante DNA
barcoding. Bol. Soc. Argent. Bot.
55: 479-492.
DOI: https://doi.
org/10.31055/1851.2372.v55.
n3.28030
Mariana Arias Aburto
1
, Delia Ramírez Medina
1
y Roberto Contreras Díaz
1,2
*
análISIS taxonómIco molecular de IndIvIduoS del
género
lathyruS
halladoS en el extremo norte de
chIle, medIante dna barcodIng
molecular taxonomIc analySIS of IndIvIdualS of the genuS
lathyruS
found In the northern extreme of chIle, uSIng dna barcodIng
Recibido: 28 Marzo 2020
Aceptado: 1 Septiembre 2020
Publicado: 30 Septiembre 2020
Editora: Viviana Solís Neffa
ISSN versión impresa 0373-580X
ISSN versión on-line 1851-2372
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de plantas que se encuentran en el desierto de
Atacama están representados por pocas especies,
y solo unos pocos géneros son diversos (Heibl &
Renner, 2012). La Región de Arica-Parinacota
se encuentra dentro del Norte Grande de Chile,
y posee una gran diversidad de ora vascular
concentrada en mayor grado en la provincia de
Parinacota (Luebert & Gajardo, 2005; Faúndez
et al., 2014). De acuerdo a Gatica-Castro et al.
(2015), la ora de la Región de Arica-Parinacota
está integrada por 596 especies, de ellas 98
son endémicas de Chile y 10 son endémicas
de la región. En un recorrido realizado por
esta región, específicamente en la Quebrada
de Vitor, descubrimos algunos individuos de
plantas orales (de color púrpura y crema) que
de acuerdo a sus características morfológicas
podrían pertenecer al género Lathyrus L. Sin
embargo, hacia el norte de Chile, desde la Región
de Arica-Parinacota hasta la Región de Tarapacá
no se han registrado especies de este género
(Rodriguez et al., 2018).
El género Lathyrus es miembro de la tribu
Vicieae (Familia Fabaceae) que comprende
aproximadamente 160 especies (Simola,
1968; Kupicha, 1983; Skiba et al., 2007).
Principalmente se encuentran distribuidas en los
climas templados del hemisferio norte, siendo
el principal centro de diversidad del género
la región Mediterránea Oriental; mientras que
el oeste de los Estados Unidos y la región sur
de Argentina y Chile, representan centros de
diversidad secundarios (Burkart, 1935, 1942;
Senn, 1938; Kenicer, 2008). Todas las especies
de Lathyrus son herbáceas, con alrededor de 40
especies anuales y 120 perennes (Kenicer, 2008).
Desde un punto de vista morfológico, el
género Lathyrus se caracteriza por presentar
tallos angulosos, hojas pinnadas con un zarcillo
terminal, ores solitarias que varían en color de
azul, rojo y blanco, así como vainas que contienen
de tres a cinco semillas (Skiba et al., 2007).
Todas las especies de Lathyrus de Sudamérica
poseen hojas con un par de foliolos, excepto L.
macropus Gill y L. multiceps Clos, en cambio
las especies de Lathyrus de Norteamérica poseen
hojas con dos o más pares de foliolos, excepto L.
pusillus Ell. (Burkart, 1942). Los datos de ADN
sugieren que las especies sudamericanas están
más estrechamente relacionadas con las especies
del oeste de Eurasia (Kenicer, 2008). La mayoría
de las especies del género Lathyrus son diploides
(2n= 14) (Naravan & Durrant 1983; Yamamoto et
al., 1984; Chalup & Seijo, 2007).
En Chile, se ha registrado el género Lathyrus
creciendo de manera natural desde la Región
de Antofagasta hasta la Región de Magallanes,
habiendo específicamente tres especies
endémicas: L. berteroanus Colla ex Savi, L.
lomanus I.M. Johnst., L. subandinus Phil.; trece
especies nativas: L. cabrerianus Burkart, L.
campestris Phil., L. crassipes Gillies ex Hook.
& Arn., L. hookeri G. Don, L. macropus Gillies
ex Hook. & Arn., L. magellanicus Lam. var.
glaucescens Speg., L. magellanicus Lam. var.
longipes (Phil.) Burkart, L. magellanicus Lam.
var. magellanicus, L. magellanicus Lam. var.
tucumanensis Burkart, L. multiceps Clos, L.
nervosus Lam., L. pubescens Hook. & Arn.,
L. pusillus Elliott; y cuatro especies exóticas
asilvestradas y naturalizadas: L. cicera L., L.
japonicus Willd., L. sativus L. y L. hirsutus
L. (Burkart, 1942; Calvo & Moreira-Muñoz,
2018; PNUD, 2017; Rodriguez et al., 2018).
Adicionalmente, se han ingresado semillas de L.
odoratus L. a Chile, como parte de solicitud de
importación comercial para su venta con nes
ornamentales (SAG, 2020).
La diferenciación de las especies del género
Lathyrus es dicultosa debido a su homoplasia
morfológica, como la forma de la estípula, el
número de foliolos y la presencia de zarcillos,
siendo dicha homoplasia el principal desafío
en su clasicación (Kupicha, 1983; Kenicer et
al., 2005). Esta preponderancia de caracteres
compartidos ha llevado a la realización de
estudios logenéticos moleculares en Lathyrus,
en los cuales se ha dividido a este género en 12 o
13 secciones (Czefranova, 1971; Kupicha, 1983;
Asmussen & Liston, 1998; Kenicer et al., 2005).
El “DNA Barcoding” (código de barras de
ADN) es una técnica de diagnóstico para la
identicación de especies, que utiliza una región
de ADN corta y estandarizada (Lahaye et al.,
2008; Contreras et al., 2020a). El código de barras
del ADN en plantas implica la secuenciación de
segmentos cortos del genoma de cloroplastos
o nuclear para comparar los resultados con
secuencias de referencia ortólogas disponibles
en bases de datos públicas como BOLD (www.
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M. Arias Aburto et al. - Análisis taxonómico molecular en Lathyrus
boldsystem.org) y GenBank (www.ncbi.nlm.
nih.gov/genbank) (Barcaccia et al., 2016).
Para la identicación de plantas, no ha habido
consenso respecto del uso de una sola secuencia
estandarizada, sin embargo, el Consorcio para
el Código de Barras de la Vida CBOL (CBOL,
2009), ha propuesto varias combinaciones de loci
de ADN plastidial, cuatro genes codicadores
(matK, rbcL, rpoB y rpoC1) y espaciadores no
codicantes (atpF–atpH, trnH–psbA, y psbK–
psbI), siendo rbcL y matK, propuestos como
un “código de barras central” para plantas
(Hollingsworth et al., 2011; Contreras et al.,
2020b). La región nuclear “internal transcribed
spacer (ITS)” ha sido utilizada de manera eciente
para la clasicación seccional a nivel del género
Lathyrus y para reconstruir logenias (Kenicer et
al., 2005). Así también, regiones rpoC (rpoC1,
intrón, rpoC2 y espaciador intergénico) e IR2
(psbA, trnH-GUG, parte de ndhF y espaciadores
intergénicos) fueron analizadas en 42 especies
de Lathyrus, conrmando la clasicación de
6 a 8 secciones (Asmussen & Liston, 1998),
mientras que el gen matK se ha utilizado para
la logenia de especies de Lathyrus de Irán y de
otras regiones de Asia (Oskoueiyan et al., 2014).
Estos marcadores han logrado ser ecaces en
la discriminación de especies de Lathyrus, por
lo tanto, utilizaremos datos de secuencias de
ITS, rpoC1, psbA-trnH y matK para clasicar
algunos individuos colectados en la Región de
Arica-Parinacota. La presente investigación
tiene por objetivo identificar genéticamente
individuos presuntamente de Lathyrus hallados
en la Quebrada Vitor de la Región de Arica-
Parinacota, mediante DNA Barcoding, con el
n de identicar especies no registradas a nivel
regional y, además, explorar un método eciente
para un género donde la homoplasia de los
caracteres morfológicos es alta.
materIaleS y métodoS
Material vegetal
Se colectaron muestras de plantas en la Quebrada
de Vitor (también llamada Quebrada de Chaca,
donde uye de manera intermitente el río Codpa),
ubicada en la Región de Arica y Parinacota,
Chile, denominadas Lathyrus 829 (flor color
Fig. 1. Localización geográca donde se colectaron las muestras Lathyrus 829 y 830. La echa de color
rojo indica la dirección y el sentido donde comienzan los cultivos agrícolas en la Quebrada de Vitor y la
echa de color azul indica la dirección y el sentido donde se posicionan las especies nativas en la misma
quebrada (sin intervención humana). El círculo rojo señala la localización exacta donde fueron colectadas
las muestras.
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crema/fucsia) (18°50’23,22”S 70° 6’34,53”W,
altitud 422 msnm) y Lathyrus 830 (or color
púrpura) (18°50’23,37”S 70° 6’34,64”W, altitud
422 msnm) (Fig. 1). En la Figura 1 se pueden
observar la ubicación de los cultivos agrícolas
y las especies nativas presentes en la Quebrada
de Vitor. Las muestras colectadas se observaron
creciendo naturalmente en la Quebrada de Vitor,
asociada a las especies Anadenanthera colubrina
(Vell.) Brenan, Phragmites australis (Cav.) Trin.
ex Steud., Atriplex sp. y Tessaria absinthioides
(Hook. & Arn.) DC., entre otras (Fig. 2). Se hizo
una revisión descriptiva de las muestras (Lathyrus
829 y 830) de acuerdo a las claves denidas por
Luchetti (2008). Las muestras fueron depositadas
en el Herbario del Departamento de Silvicultura y
Conservación de la Naturaleza de la Universidad
de Chile (EIF, Index Herbariorum Code), con
el código EIF13778 (Lathyrus 829) y EIF13779
(Lathyrus 830).
Extracción de ADN y secuenciación de
marcadores barcode
La extracción de ADN se realizó con el método
CTAB/fenol-cloroformo-alcohol isoamílico/
columna de sílice, descrito por Contreras et al.
(2019). La amplicación del marcador nuclear
ITS y marcadores plastídicos rpoC1, psbA y
matK se realizaron en una reacción de PCR
con las siguientes parejas de cebadores: rpoC1
(1F 5’-GTGGATACACTTCTTGATAATGG-3’;
4R 5’-CCATAAGCATATCTTGAGTTGG-3’)
(Kress et al., 2005); ITS1-ITS2 (P674
5’-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3’; ITS-4
5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (Stanford
et al., 2000; Kress et al., 2005); matK (2.1f
5´-CCTATCCATCTGGAAATCTTAG-3´; 1326R
5’-TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT-3’)
(Cuénoud et al., 2002; Dong e t
al., 2013); y psbA-trnH ( trnHf0 5
5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’; psbA3f
Fig. 2. A: Flor de Lathyrus 829 color blanco-fucsia y or de Lathyrus 830 de color púrpura. B: Lathyrus 830;
C: Lathyrus 829.
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M. Arias Aburto et al. - Análisis taxonómico molecular en Lathyrus
5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’)
(CBOL, 2009). Las reacciones de PCR con cada
pareja de cebador se preparó a un volumen total
de 24 µL como se describe a continuación: 12
µL de Master Mix SapphireAmp Fast PCR 2X
(Takara-Clontech, Kusatsu, Japón), 1,5 µL de
cada cebador forward y reverse (5 µM), 3 µL de
agua libre de nucleasas y 6 µL de ADN genómico
(5 ng µL
-1
). Las amplicaciones se realizaron en
un termociclador MultiGene OptiMax (Labnet
International, Edison, USA) con las siguientes
condiciones: un paso inicial de 10 min a 95
°C, 35 ciclos de amplicación con 40 s a 95
°C, 40 s de temperatura de anillamiento según
marcador (matK 55°C, ITS 56°C, rpoC1 53°C
y psbA-trnH 58°C) y 40 s a 72 °C, seguido por
un paso de extensión nal de 7 min a 72 °C. Los
productos de PCR fueron visualizados en geles
de agarosa a 1,5%, en tampón TBE 0,5 X y teñido
con GelRed
TM
Nucleic Acid Gel Stain a 0,1 %
(Biotium, California, USA). Luego se puricó
el producto de PCR con el kit de puricación
Kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System
(Promega, Wisconsin, USA) y finalmente se
envió a secuenciar a la empresa Macrogen Inc.
(Corea del Sur).
Análisis de datos
Se editaron las secuencias de ADN “Forward”
y “Reverse” con el software Chromas Pro
v1 (Technelysium Pty, Ltd) y se ensamblaron
utilizando el programa DNA Baser Sequence
Assembler (v4.10) donde se aplicaron ajustes
y análisis automáticos predeterminados para la
edición de “contig” (Biosoft, 2012). Para realizar
los análisis se descargaron varias secuencias
de especies del género Lathyrus que mostraron
máximo puntaje de alineación con nuestro
segmento consultado en “GenBank” (BLASTn),
siendo en total 10 secuencias para el marcador ITS
(JN115031, MN736435, DQ311968, AY839344,
DQ311967, AY839383, AY839359, AY839405,
AM401152, JQ309787), 13 secuencias rpoC1
(KJ850238, KJ850235, KJ806193, KJ806196,
KJ806195, KJ806199, KJ850236, KJ806202,
KP126867, KJ806192, KJ806200, KJ806201,
KJ850237), 7 secuencias psbA-trnH (KJ850237,
JX505926, HE966680, JX505951, JX505952,
KJ806192, KJ806193), 9 secuencias matK
(KJ850237, JX505798, JX505815, AF522085,
KX676551, KM487289, KJ806201, KJ850238,
KJ850236) y otras secuencias de Lathyrus
(KJ806236, KJ806198) (Tabla S1). Para cada
marcador se usaron dos secuencias de ADN del
género Vicia L., como grupo externo, siendo
estas Vicia cracca L. (JQ309787, JX505993),
Vicia sativa var angustifolia (L.) ex Reichard
(KJ787206), Vicia pisiformis L. (JX506029),
Vicia nigricans Hook. & Arn. (AF522155), Vicia
crocea (Desf.) B. Fedtsch (HM026406), Vicia
sepium L. (MG682352) y Vicia ramuliora L
(MN758738). Las secuencias de las muestras y
las secuencias descargadas se alinearon usando
el software MEGA 6 (Tamura et al., 2013), para
cada uno de los marcadores “barcode” usados.
Para evaluar la logenia se utilizó el método de
agrupamiento Neighbor Joining (NJ) e Inferencia
Bayesiana (IB). El análisis NJ y las distancias
genéticas por pares de especies fueron inferidos
basados en el modelo Tamura-Nei (Tamura
& Nei, 1993) utilizando el software MEGA6
(Tamura et al., 2013) y para la conabilidad
del soporte de los análisis se utilizaron 1000
réplicas de bootstrap (BS). El análisis de IB se
llevó a cabo con MrBayes 3.2 (Ronquist et al.,
2012). Se utilizó el programa Mr.Modeltest 2.3
(Nylander, 2008) para explorar el mejor modelo
de evolución que se ajusta a los datos de las
secuencias de ADN, basado en “corrected Akaike
Information Criterion (AICc)”. Una prueba de
razón de probabilidad jerárquica implementada
con el programa MrModeltest y AICc sugirió
que el modelo de evolución que mejor se ajusta
es SYM+G para datos ITS, GTR+G para datos
matK, GTR+I para datos psbA-trnH, GTR+I+G
para datos rpoC1 y para datos concatenados de
marcadores de cloroplasto (matK+psbA+rpoC1).
Se efectuaron dos análisis independientes de
Cadenas de Monte Carlo Markov (CMCM) que
consta cada una de 3.000.000 generaciones,
obtenidos con una desviación promedio de
frecuencias inferior a 0,006. Los árboles se
muestrearon con una frecuencia cada 1000
generaciones, y el 25% de los primeros árboles
se desecharon como “burn-in”. Se utilizó el
programa TRACER v. 1.5 (Rambaut &
Drummond, 2007) para vericar la estabilidad de
la probabilidad general y la convergencia entre
generaciones de los análisis ejecutados con Mr
Bayes. La abilidad de los clados en el análisis
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bayesiano se evaluó por medio de la probabilidad
a posteriori (PP). Los valores de PP bajo 0,80 se
consideraron de bajo soporte; entre 0,80 y 0,89
se consideraron como moderado; y los valores
de PP superiores a 0,90 como alto soporte. En el
análisis, los valores de bootstrap (BS) para los
nodos internos se estimaron con 100 réplicas,
siendo confiables los valores mayores a 70.
Se considera generalmente que un grupo está
apoyado de forma concluyente cuando el valor de
“bootstrap” es mayor a 70, lo que generalmente
corresponden a una probabilidad del 95% de
consistencia del agrupamiento (Hillis & Bull,
1993). Todos los dendrogramas fueron editados
usando el programa FigTree 1.4.0 (Rambaut,
2012).
reSultadoS
El árbol logenético de las secuencias ITS,
mediante el método NJ, presenta una separación
basal de dos grupos monoléticos y dos especies
de Vicia (V. cracca y V. sativa var angustifolia)
como grupo externo, por un lado, se encuentra el
clado conformado por las especies Lathyrus 829,
Lathyrus 830, L. odoratus, estas secuencias están
relacionadas entre sí, correspondiendo al mismo
taxón con un soporte de 96%, y en el mismo grupo
se encuentran las especies L. cassius Boiss., L.
sativus, L. annuus L., y L. laevigatus (Waldst. &
Kit.) Gren., por otro lado, se distingue el clado
que agrupa monoléticamente a las especies,
L. polyphyllus Nutt., L. holochlorus (Piper) C.
Hitchc, L. vestitus Nutt., L. ledebourii Trautv., L.
pannonicus (Jackq.) Gracke (Fig. 3A). A su vez,
el árbol logenético obtenido mediante el método
de IB, muestra que Lathyrus 829, Lathyrus 830,
y L. odoratus, corresponden al mismo taxón
(PP=1,00), además emparentado con L. cassius
(Fig. 3B). Las distancias genéticas entre pares de
especies de Lathyrus revelado por el marcador
ITS se pueden observar en la Tabla S2.
El árbol que muestra las relaciones logenéticas
de Lathyrus con las secuencias psbA-trnH, con el
método NJ, muestra dos grupos monoléticos y
dos especies de Vicia (V. pisiformis y V. cracca)
del grupo externo, por una parte, se encuentra
un grupo monolético el cual contiene un clado
con politomía en su base, conformado por las
muestras de Lathyrus 829, Lathyrus 830 y L.
odoratus las que corresponderían a un mismo
taxón esto con un soporte de 88%, en este grupo
monolético también se encuentran las especies
L. hirsutus, L. latifolius L., L. roseus Steven
y L. rotundifolius Willd. Un segundo grupo
monolético está formado por L. davidii Hance y
L. graminifolius (S. Watson) T. White (Fig. 4A).
Fig. 3. Relaciones logenéticas basadas en secuencias ITS de Lathyrus 829 y 830 y otras especies
del género Lathyrus. A: Árbol logenético realizado mediante método NJ, basado en el modelo modelo
Tamura-Nei, los nodos presentan valores bootstrap. B: Árbol logenético obtenido mediante IB (modelo de
evolución SYM+G), cuyos nodos indican valores PP.
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M. Arias Aburto et al. - Análisis taxonómico molecular en Lathyrus
El árbol generado con el método de IB, muestra
que las secuencias de Lathyrus 829, Lathyrus
830 y L. odoratus son similares (PP=1,00) y
están emparentadas a L. hirsutus (Fig. 4B). Las
distancias genéticas entre pares de especies de
Lathyrus revelado por el marcador psbA-trnH se
pueden observar en la Tabla S3.
El árbol con las secuencias matK en Lathyrus,
dió como resultado dos grupos monoléticos y
dos especies de Vicia (V. nigricans Hook. & Arn.
y V. crocea (Desf.) Fritsch) del grupo externo, un
clado constituido por Lathyrus 829, L. odoratus
y Lathyrus 830, las cuales están relacionadas
entre sí y se encuentran emparentadas a L.
hirsutus con un soporte de 94%, además en este
grupo se encuentran las especies L. roseus, L.
latifolius, L. sylvestris L., L. cicera y L. sativus.
Un segundo clado que incluye L. tinginatus L. y
L. inconspicuus L. (Fig. 5A). Por el método IB,
el árbol logenético generado agrupa en un clado
Fig. 4. Relaciones logenéticas basadas en secuencias psbA-trnH de Lathyrus 829 y 830 y otras especies
del género Lathyrus. A: Árbol logenético realizado mediante método NJ, basado en el modelo modelo
Tamura-Nei, los nodos presentan valores bootstrap. B: Árbol logenético obtenido mediante IB (modelo de
evolución GTR+I), cuyos nodos indican valores PP.
Fig. 5. Relaciones logenéticas basadas en secuencias matK de Lathyrus 829 y 830 y otras especies
del género Lathyrus. A: Árbol logenético realizado mediante método NJ, basado en el modelo modelo
Tamura-Nei, los nodos presentan valores bootstrap. B: Árbol logenético obtenido mediante IB (modelo de
evolución GTR+G), cuyos nodos indican valores PP.
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a Lathyrus 829, Lathyrus 830 y L. odoratus,
las cuales son secuencias idénticas (PP=1,00),
además se encuentran emparentadas a L. hirsutus,
con una probabilidad a posterior de 0,99 (Fig.
5B). Las distancias genéticas entre pares de
especies de Lathyrus revelado por el marcador
matK se pueden observar en la Tabla S4.
El árbol filogenético generado con las
secuencias rpoC1 en Lathyrus con el método NJ,
indica la formación de dos grupos monoléticos,
un primer gran grupo conformado por L.
tinginatus, L. clymenum L., L. graminifolius, L.
littoralis (Nutt.) Endl., L. japonicus, L. palustris
L. y L. inconspicuus, además dos especies de
Vicia (V. sepium y V. ramuliora). Un segundo
grupo monolético conformado por L. venosus
Muhl. ex Willd., L. decaphyllus Pursh y L.
davidii, además formando un clado las especies
L. pubescens y L. sativus con Lathyrus 829,
Lathyrus 830 y L. odoratus (Fig. 6A). Además,
el árbol logenético generado por el método
IB indica que Lathyrus 829, Lathyrus 830 y
L. odoratus se encuentran en una rama aparte
(PP=1,00), formando un taxón (Fig. 6B). Las
distancias genéticas entre pares de especies de
Lathyrus revelado por el marcador rpoC1 se
pueden observar en la Tabla S5.
El árbol filogenético de secuencias
concatenadas (psbA-trnH, matK y rpoC1),
mediante el método NJ, presenta una separación
basal de dos grupos monoléticos y una especies
de Vicia (V. ramuliora) del grupo externo, por
un lado, se encuentra el clado conformado por
las especies Lathyrus 829, Lathyrus 830, L.
odoratus, relacionadas entre sí, como un mismo
taxón con un soporte de 100%, y en el mismo
grupo se encuentran las especies L. sativus, L.
pubescens y L. inconspicuus. Por otro lado, se
distingue un clado que agrupa monoléticamente
a las especies, L. graminifolius, L. japonicus, L.
davidii, L. venosus y L. ochroleucus Hook. (Fig.
7A). A su vez, el árbol logenético obtenido
mediante el método de IB, muestra que Lathyrus
829, Lathyrus 830, y L. odoratus, corresponden
al mismo taxón (PP=1,00), emparentado con L.
sativus (Fig. 7B).
En cuanto a caracterización morfológica,
las muestras Lathyrus 829 y Lathyrus 830
mostraron racimos de 1 hasta 4 ores, cada or
de aproximadamente 4 cm de longitud, de color
púrpura o azul y blanco-fucsia, hojas levemente
pubescentes y peciolos alados. Dado estos rasgos,
las características morfológicas de Lathyrus 829
y Lathyrus 830 se acercarían a la descripción de
L. odoratus, de acuerdo a las claves descritas por
Luchetti (2008).
Fig. 6. Relaciones logenéticas basadas en secuencias rpoC1 de Lathyrus 829 y 830 y otras especies
del género Lathyrus. A: Árbol logenético realizado mediante método NJ, basado en el modelo modelo
Tamura-Nei, los nodos presentan valores bootstrap. B: Árbol logenético obtenido mediante IB (modelo de
evolución GTR+I+G), cuyos nodos indican valores PP.
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Bol. Soc. Argent. Bot. 55 (3) 2020
M. Arias Aburto et al. - Análisis taxonómico molecular en Lathyrus
dIScuSIón
Los cuatro loci de DNA barcoding, como la
secuencia de ADN nuclear ITS y las secuencias
de ADN cloroplastídico psbA-trnH, matK y rpoC1
permitieron identicar genéticamente las muestras
identicadas como Lathyrus 829 y Lathyrus 830,
recolectadas en Arica, Chile. Los resultados indican
que estas muestras están relacionadas a L. odoratus,
lo cual se encuentra fuertemente apoyado por
los arboles de consenso generados a partir de los
análisis logenéticos NJ e IB, como monolética y
separado de otras especies. Consecuentemente los
métodos moleculares juegan un papel importante
en la estimación de la relación entre individuos
al comparar los genotipos con una serie de loci
informativos (Sunnucks, 2000).
El primer árbol logenético generado a partir
de la secuencia ITS del presente trabajo, indica
que el primer clado monolético que incluye L.
odoratus, L. cassius, L. sativus y L. annuus, con un
soporte bootstrap de 87%, corresponde a la sección
Lathyrus. Los taxones L. odoratus, L. sativus
y L. annuus se agrupan en la sección Lathyrus
del árbol de consenso estricto de Asmussen &
Liston (1998) basados en secuencias rpoC e IR2.
Adicionalmente, estas tres especies están agrupadas
en la sección Lathyrus del árbol resultante del
análisis combinado se secuencias ITS, trnL-F
y trnS-G de acuerdo a Kenicer et al. (2005). La
especie L. cassius se incluye en la sección Lathyrus
a partir del árbol resultante del análisis de las
secuencias matK según Oskoueiyan et al. (2014).
Este primer clado también incluye a L. laevigatus,
el cual corresponde a la sección Orobus (Kenicer et
al., 2005). El segundo clado monolético incluye
especies de la sección Orobus y Lathyrostylis. Las
especies L. polyphyllus, L. holochlorus, L. vestitus
pertenecen a la sección Orobus (Kenicer et al.,
2005). Por otro lado, las especies L. ledebourii y L.
pannonicus, se incluyen en la sección Lathyrostylis
(Kupicha, 1983). De acuerdo a lo señalado por
Asmussen & Liston (1998), es muy importante la
comparación de logenias de Lathyrus con ADN de
genes nucleares (como por ejemplo ITS), debido a
que pueden existir discrepancias entre los “árboles
de genes” de cloroplasto.
En el segundo árbol logenético generado a
partir de las secuencias psbA-trnH, la especie L.
odoratus se agrupa junto a L. hirsutus, L. latifolius,
L. roseus y L. rotundifolius, que corresponden a
la sección Lathyrus (Asmussen & Liston, 1998;
Kenicer et al., 2005; Oskoueiyan et al., 2014) y
el segundo clado de este árbol, que involucra a L.
davidii y L. graminifolius pertenece a la sección
Orobus (Asmussen & Liston, 1998). El tercer
Fig. 7. Relaciones logenéticas basadas en secuencias concatenadas (psbA-trnH, matK y rpoC1) de
Lathyrus 829 y 830 y otras especies del género Lathyrus. A: Árbol logenético realizado mediante método
NJ, basado en el modelo modelo Tamura-Nei, los nodos presentan valores bootstrap. B: Árbol logenético
obtenido mediante IB (modelo de evolución GTR+I+G), cuyos nodos indican valores PP.
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árbol generado a partir de las secuencias matK en
Lathyrus spp., indica que L. odoratus pertenece
a la sección Lathyrus, junto con L. hirsutus, L.
roseus, L. latifolius, L. sylvestris, L. cicera y L.
sativus (Asmussen & Liston, 1998; Oskoueiyan
et al.. 2014). Mientras que la especie L. tinginatus
pertenece a la sección Lathyrus (Kupicha, 1983;
Asmussen & Liston, 1998; Kenicer et al., 2005;
Oskoueiyan et al., 2014). Por otro lado la especie L.
inconspicuus pertenece a la sección Linearicarpus
(Kupicha 1983). El último árbol filogenético
generado a partir de las secuencias rpoC1, agrupa
dos clados monoléticos. El primer clado no tiene
una topología denida resuelta, ya que es posible
encontrar especies de distintas secciones como
de Orobus, Lathyrus, Clymenum, Linnearicarpus
(Asmussen & Liston, 1998; Kenicer et al., 2005;
Oskoueiyan et al., 2014) incluyendo especies de
Vicia del grupo externo (V. sepium y V. ramuliora).
En el segundo clado es posible encontrar también
especies de diferentes secciones como Notolathyrus
y Lathyrus (Asmussen & Liston, 1998). Sin duda,
este marcador rpoC1 no es eciente para discriminar
secciones, incluso especies de Vicia se anidaron
junto a especies de Lathyrus. Sin embargo, el
estudio desarrollado por Asmussen & Liston (1998)
con secuencias rpoC discriminó ecientemente las
secciones, esto porque además de utilizar la región
rpoC1, estudió también datos del intrón, parte de
rpoC2 y su espaciador intergénico, aportando más
información al estudio.
En el árbol de secuencias concatenadas (psbA-
trnH, matK y rpoC1), mostró un clado con especies
de la sección Lathyrus, entre ellas Lathyrus 829
y 830, L. odoratus y L. sativus, y especies de
otras secciones como L. pubescens de la sección
Notolathyrus y L. inconspicuus perteneciente a
Linearicarpus (Kupicha, 1983). Por lo tanto, no
es recomendable realizar análisis logenéticos con
estas tres regiones de secuencias concatenadas.
Es muy probable que la información de la región
rpoC1 haya disminuido la resolución de los análisis
concatenados, ya que los análisis logenéticos por
separado de las secuencias psbA-trnH y matK,
demostraron discriminar ecientemente especies y
secciones.
El principal centro de distribución de la especie
de Lathyrus es en la región Mediterránea oriental,
con pequeños centros en el Norte y Sur América
(Burkart, 1942). Sobre el origen de las especies
endémicas Sudamericanas de Lathyrus, Asmussen
& Liston (1998) sustentan la hipótesis de que éstas
derivan de linajes norteamericanos, consistente
con la teoría de Kupicha (1983), quien planteó la
hipótesis de que Lathyrus se originó en latitudes
altas del Viejo Mundo, en el Cretácico o Terciario
temprano, de aquí las especies originales de
Lathyrus con características de la sección Orobus
migraron a Norteamérica a través de Groenlandia
o de Asia a través de Alaska y luego a Sudamérica
donde la sección Notolathyrus evolucionó. Esta
ruta de dispersión de la sección Notolathyrus de
Norte a Sudamérica sigue la teoría del elemento de
ora holártica sobre el origen de especies andinas,
así como la hipótesis boreotrópica biogeográca
(Cleef, 1979; Simpson & Todzia, 1990; Lavin &
Luckow, 1993)
En este estudio, la utilidad de las secuencias
de nucleótidos de ITS, psbA-trnH y matK son
efectivas como código de barras de ADN para la
identicación de especies Lathyrus. La especie L.
odoratus se encuentra naturalizada y creciendo
de manera abundante en la Quebrada de Vitor,
en una ubicación inhóspita, al oeste de Codpa y
este del Valle de Chaca. Sin embargo, de acuerdo
al Catálogo de las Plantas Vasculares de Chile
de Rodriguez et al. (2018), L. odoratus no se
ha registrado creciendo de manera natural en
Chile. En Sudamérica se ha registrado L. odoratus
creciendo naturalmente en Perú de acuerdo al ILDIS
(International Legume Database and Information
Service) (Roskov et al., 2020) y como cultivo en
el sur de Córdoba (Argentina) (Bianco & Kraus,
1996). No obstante, esta especie es cultivada en
Chile con nes ornamentales, importándose su
material bajo estrictas normas tosanitarias (SAG,
2020). Esta especie es endémica del centro y sur de
Europa, sin embargo, como especie ornamental está
distribuida y cultivada en todo el mundo (Bianco &
Kraus, 1996). Por lo tanto, es posible que por ser
una especie ornamental de amplio rango de cultivo,
probablemente algún material de propagación de
esta especie (en parcelas y jardines de agricultores
ubicados a 2.000 m.s.n.m.) se diseminó producto de
aluviones (producidos continuamente en la región
cada año) y colonizó parte de la Quebrada de Vitor.
Sin embargo, también es probable que esta especie
haya sido introducida en la Quebrada de Vitor por
colonos españoles.
Cabe mencionar que la Quebrada de Vitor,
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M. Arias Aburto et al. - Análisis taxonómico molecular en Lathyrus
es un área de interés para la conservación de la
biodiversidad, allí se desarrollan especies nativas y
además se han colectado varias especies vegetales
de interés de conservación por su singularidad
y escasa distribución en Chile, como es el caso
de Haplorhus peruviana Engl. (especie rara) y
Solanum peruvianum L, sin embargo, la actividad
humana es evidente tanto por las parcelas, los
cultivos y la introducción de numerosas malezas
y especies forestales (Estades et al., 2009). El
hallazgo reciente de L. odoratus en la Quebrada
de Vitor, podría ser un riesgo para la conservación
de la biodiversidad. Considerando que L. odoratus
es una especie de fácil propagación, la cual podría
constituirse como maleza que afecte a las especies
nativas del lugar. El consumo de esta planta podría
afectar a la fauna endémica, roedores exclusivos de
la zona (Acevedo & Olivares, 2012), ya que podría
causar latirismo u osteolatirismo con consecuente
deformidades esqueléticas, producto de la presencia
de aminonitrilos neurotóxicos (McKay et al., 1954;
Stamler, 1955). Según Kumar & Duggal (2017),
L. odoratus es una maleza nociva que afecta a los
cultivos, cuyo hábito de enroscarse le permite una
supervivencia mejor que otras malezas, lo cual le
permite consumir grandes cantidades de recursos
del hábitat y a su vez compite con especies nativas
o cultivos. Sin duda este aspecto es importante de
considerar si se piensa en mantener las condiciones
actuales de esta zona geográca. Considerando que
para el Desierto de Atacama ya se han registrado
19 especies orales exóticas, como invasivas o
con potencial invasivo, las cuales están afectando
la biota nativa, estableciéndose en ecosistemas no
intervenidos por el hombre, como orillas de esteros
o en los sistemas costeros (Salinas, 2016). A todas
luces esta especie podría tratarse de una especie
introducida e invasora, que puede desequilibrar el
ecosistema afectando la ora y fauna de la zona.
Sin lugar a dudas, la conservación y protección de
áreas de carácter único, que representan diversidad
ecológica natural, asegura la continuidad de los
procesos evolutivos, los patrones de ujo genético
y la regulación del medio ambiente.
La presente investigación mediante relaciones
logenéticas con cuatro marcadores de código de
barras de ADN (matK, ITS, psbA-trnH y rpoC1)
evidenció el primer registro de individuos anes
a L. odoratus creciendo de manera natural en
Chile. Las secuencias ITS, psbA-trnH y matK
demostraron ser ecientes en discriminar especies
y secciones, sin embargo, la región rpoC1 no se
recomienda su uso para diferenciar secciones de
Lathyrus.
contrIbucIón de loS autoreS
RC diseñó la investigación, coleccionó el
material de campo y registró las muestras en
herbario. MA y DR procesaron las muestras y
realizaron los ensayos moleculares. MA y RC
participaron en los análisis de datos y la escritura
del manuscrito.
agradecImIentoS
Los autores agradecen los valiosos comentarios
entregados por los árbitros anónimos. Esta
investigación fue nanciada por el Fondo Regional
de Innovación para la Competitividad Regional
(FIC Regional, 2018) del Gobierno Regional de
Atacama, Código BIP 40013338-0. Agradecemos
el apoyo entregado por los profesionales de la
Secretaría Regional Ministerial de Medio Ambiente
de la Región de Arica-Parinacota y datos de especies
facilitados por la académica Eliana Belmonte
Schwarzbaum de la Universidad de Tarapacá.
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Bol. Soc. Argent. Bot. 55 (3) 2020
M. Arias Aburto et al. - Análisis taxonómico molecular en Lathyrus
Tabla S1. Sección, nombre cientíco y accesión de especies de Lathyrus
Sección Nombre cientíco Accesión
Lathyrus L. cassius Boiss MN736435
Lathyrus L. sativus L. DQ311968, KJ806201
Lathyrus L. annuus L. AY839344
Lathyrus L. odoratus L. JN115031, KJ850237
Lathyrus L. hirsutus L. JX505926
Lathyrus L. latifolius L HE966680
Lathyrus L. roseus Steven JX505951
Lathyrus L. rotundifolius Willd JX505952
Lathyrus L. sylvestris L. KX676551
Lathyrus L. cicera L. KM487289
Lathyrus L. tinginatus L. KJ850238
Orobus L. laevigatus (Waldst. & Kit.) Gren. DQ311967
Orobus L. polyphyllus Nutt. AY839383
Orobus L. holochlorus (Piper) C. Hitchc AY839359
Orobus L. vestitus Nutt. AY839405
Orobus L. davidii Hance KJ806192
Orobus L. graminifolius (S. Watson) T. White KJ806193
Orobus L. littoralis (Nutt.) Endl. KJ806196
Orobus L. palustris L. KJ806199
Orobus L. venosus Muhl. ex Willd. KJ806202
Orobus L. japonicus Willd. KJ806195
Lathyrostylis L. ledebourii Trautv. AY839405, AM401152
Lathyrostylis L. pannonicus (Jackq.) Gracke FN568033
Linearicarpus L. inconspicuus L. KJ850236
Clymenum L. clymenum L. KJ850235
------- L. decaphyllus Pursh KP126867
Notolathyrus L. pubescens Hook. & Arn KJ806200
------- L. ochroleucus Hook. KJ806198
materIal SuPlementarIo
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Tabla S2. Distancia genética entre pares de especies de Lathyrus y de Vicia del grupo externo revelada
por el marcador ITS
Taxon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Lathyrus_829
Lathyrus_830 0,000
JN115031.1_
Lathyrus_odoratus
0,002 0,002
AY839383.1_
Lathyrus_polyphyllus
0,019 0,019 0,017
DQ311968.1_
Lathyrus_sativus
0,016 0,016 0,018 0,019
AM401152.1_
Lathyrus_ledebourii
0,024 0,024 0,026 0,011 0,024
DQ311967.1_
Lathyrus_laevigatus
0,021 0,021 0,019 0,014 0,021 0,023
AY839359.1_Lathyrus_
holochlorus
0,028 0,028 0,026 0,011 0,028 0,019 0,023
AY839405.1_
Lathyrus_vestitus
0,019 0,019 0,021 0,006 0,019 0,011 0,018 0,014
FN568033.1_
Lathyrus_pannonicus
0,024 0,024 0,026 0,011 0,024 0,009 0,023 0,019 0,011
MN736435.1_
Lathyrus_cassius
0,014 0,014 0,016 0,021 0,018 0,026 0,022 0,029 0,021 0,026
AY839344.1_
Lathyrus_annuus
0,013 0,013 0,014 0,016 0,013 0,021 0,018 0,024 0,016 0,021 0,014
JQ309787.1_
Vicia_cracca
0,059 0,059 0,057 0,052 0,059 0,061 0,057 0,058 0,056 0,061 0,063 0,058
KJ787206.1_Vicia_
sativa_var._angustifolia
0,049 0,049 0,051 0,042 0,049 0,043 0,047 0,045 0,041 0,043 0,051 0,044 0,047
Tabla S3. Distancia genética entre pares de especies de Lathyrus y de Vicia del grupo externo revelada
por el marcador psbA-trnH
Taxon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Lathyrus_829
Lathyrus_830 0,000
KJ850237.1_Lathyrus_odoratus 0,000 0,000
KJ806192.1_Lathyrus_davidii 0,026 0,026 0,026
KJ806193.1_Lathyrus_graminifolius 0,030 0,030 0,030 0,003
HE966680.1_Lathyrus_latifolius 0,016 0,016 0,016 0,023 0,026
JX505952.1_Lathyrus_rotundifolius 0,010 0,010 0,010 0,016 0,019 0,006
JX505951.1_Lathyrus_roseus 0,013 0,013 0,013 0,019 0,023 0,010 0,003
JX505926.1_Lathyrus_hirsutus 0,013 0,013 0,013 0,026 0,030 0,016 0,010 0,013
JX505993.1_Vicia_cracca 0,164 0,164 0,164 0,159 0,164 0,164 0,154 0,159 0,164
JX506029.1_Vicia_pisiformis 0,085 0,085 0,085 0,077 0,081 0,081 0,074 0,077 0,086 0,126
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M. Arias Aburto et al. - Análisis taxonómico molecular en Lathyrus
Tabla S4. Distancia genética entre pares de especies de Lathyrus y de Vicia del grupo externo revelada
por el marcador matK
Taxon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Lathyrus_829
Lathyrus_830 0,000
KJ850237.1_
Lathyrus_odoratus
0,000 0,000
JX505815.1_
Lathyrus_roseus
0,006 0,006 0,006
AF522085.1_
Lathyrus_latifolius
0,009 0,009 0,009 0,003
JX505798.1_
Lathyrus_hirsutus
0,005 0,005 0,005 0,006 0,009
KM487289.1_
Lathyrus_cicera
0,021 0,021 0,021 0,014 0,017 0,021
KJ806201.1_
Lathyrus_sativus
0,024 0,024 0,024 0,017 0,020 0,024 0,003
KJ850238.1_
Lathyrus_tingitanus
0,026 0,026 0,026 0,020 0,022 0,026 0,024 0,026
KJ850236.1_Lathyrus_
inconspicuus
0,026 0,026 0,026 0,022 0,022 0,026 0,029 0,032 0,024
KX676551.1_
Lathyrus_sylvestris
0,012 0,012 0,012 0,005 0,003 0,012 0,018 0,021 0,025 0,025
AF522155.1_
Vicia_nigricans
0,042 0,042 0,042 0,037 0,037 0,039 0,038 0,040 0,036 0,030 0,037
HM026406.1_
Vicia_crocea
0,046 0,046 0,046 0,042 0,042 0,043 0,049 0,052 0,042 0,037 0,045 0,026
Bol. Soc. Argent. Bot. 55 (3) 2020
Tabla S5. Distancia genética entre pares de especies de Lathyrus y de Vicia del grupo externo revelada por el marcador rpoC1
Taxon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Lathyrus_829
Lathyrus_830 0,000
KJ850237.1_Lathyrus_odoratus 0,000 0,000
KJ806199.1_Lathyrus_palustris 0,026 0,026 0,026
KJ806201.1_Lathyrus_sativus 0,028 0,028 0,028 0,023
KJ806196.1_Lathyrus_littoralis 0,028 0,028 0,028 0,009 0,024
KJ806200.1_Lathyrus_pubescens 0,030 0,030 0,030 0,023 0,032 0,024
KJ850238.1_Lathyrus_tingitanus 0,032 0,032 0,032 0,014 0,030 0,015 0,035
KJ850235.1_Lathyrus_clymenum 0,032 0,032 0,032 0,012 0,028 0,010 0,032 0,015
KJ806195.1_Lathyrus_japonicus 0,032 0,032 0,032 0,009 0,028 0,003 0,028 0,015 0,010
KJ806202.1_Lathyrus_venosus 0,033 0,033 0,033 0,017 0,026 0,017 0,030 0,030 0,028 0,021
KJ806193.1_Lathyrus_graminifolius 0,033 0,033 0,033 0,014 0,026 0,012 0,030 0,021 0,015 0,012 0,024
KJ806192.1_Lathyrus_davidii 0,035 0,035 0,035 0,012 0,028 0,014 0,028 0,026 0,024 0,017 0,019 0,023
KP126867.1_Lathyrus_decaphyllus 0,037 0,037 0,037 0,021 0,035 0,017 0,032 0,033 0,028 0,021 0,017 0,023 0,023
KJ850236.1_Lathyrus_inconspicuus 0,041 0,041 0,041 0,017 0,035 0,026 0,033 0,032 0,030 0,026 0,028 0,028 0,030 0,035
MG682352.1_Vicia_sepium 0,035 0,035 0,035 0,023 0,032 0,028 0,033 0,030 0,028 0,028 0,033 0,026 0,028 0,037 0,037
MN758738.1_Vicia_ramuliora 0,041 0,041 0,041 0,021 0,037 0,023 0,043 0,024 0,019 0,023 0,037 0,028 0,033 0,041 0,039 0,023